不同溫度下雌激素對(duì)施氏鱘早期性腺發(fā)育及血清性激素的影響

張 穎，孫大江，曲秋芝，劉海金

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141）

施氏鱘（Acipenser schrenckii）為鱘科魚(yú)類(lèi)，俗名七粒浮子，分布于中俄界河的黑龍江及其附屬水系。近年來(lái)，由于環(huán)境惡化及過(guò)渡捕撈使野生施氏鱘的資源急劇下降，目前為我國(guó)Ⅱ級(jí)保護(hù)種類(lèi)[1]。鱘魚(yú)籽醬具有“黑色黃金”之稱(chēng)，國(guó)際市場(chǎng)上高達(dá)500～700 美元·kg－1[3]。因此，在鱘魚(yú)商品魚(yú)養(yǎng)殖利潤(rùn)空間穩(wěn)定的情況下，鱘魚(yú)的全雌化生產(chǎn)將提高鱘魚(yú)養(yǎng)殖的利潤(rùn)空間，促進(jìn)鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

自Yamamoto等1969年提出了性激素在誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)性別轉(zhuǎn)換方面的作用后，該方法已成功在50多種海、淡水魚(yú)類(lèi)的全雌化生產(chǎn)中應(yīng)用[4－6]。外源雌激素誘導(dǎo)法因其操作簡(jiǎn)單，在幼魚(yú)時(shí)期即可操作，省時(shí)省力，成為鱘魚(yú)全雌化生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。但由于諸多因素的限制，目前也僅在短吻鱘、意大利鱘和雜交鱘中有成功的報(bào)道，如Grandi等采用17β－E2400 μg·L－1浸泡意大利鱘受精卵后，促使意大利鱘的性分化提前[7－10]。Shawn等的研究表明濃度分別為10、50 和 100 mg·kg－1的 17β－E2對(duì) 5 月齡的短吻鱘（Acipenser brevirostrum）持續(xù)投喂9個(gè)月后的雌性化誘導(dǎo)率分別是65%和58%[8]。Nataka等對(duì)已發(fā)生性分化的3月齡的雜交鱘（Huso huso♀×Acipenser ruthenus♂）投 喂 1 μg·g－117β －E2和 17α －methyltestosterone（MT）450 d后可發(fā)生雌性化和雄性化[11]。目前尚末在施氏鱘中有相關(guān)報(bào)道。此外，魚(yú)類(lèi)的性別是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用共同決定的。在諸多的環(huán)境因素中，研究較多的是溫度對(duì)性腺分化的影響。不同的溫度可誘導(dǎo)不同種魚(yú)類(lèi)的性腺向雄性或雌性分化。如在高溫（36℃）下，奧利亞羅非魚(yú)（Oreochromis aureus）雄性率可達(dá)98%。在（32±1）℃的條件下[12]，泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的雄性率可達(dá)90%[13]。而在一些魚(yú)類(lèi)則相反，如南美洲的另一種銀漢魚(yú)（Odontesthes bonariensis）在低溫（17℃）下，雌性率達(dá)100%，在高溫（29℃）下則為0%[14]，而溫度對(duì)鱘魚(yú)性分化作用方面還未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用溫度和外源雌激素注射的誘導(dǎo)方法，期望在施氏鱘性腺發(fā)育早期了解其性腺分化、性別比率和血清性激素水平，了解溫度和外源雌激素在施氏鱘發(fā)育早期對(duì)其性分化的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

試驗(yàn)用魚(yú)采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚(yú)繁育工程中心在2010年4月下旬自繁純種施氏鱘。人工飼料開(kāi)口馴化結(jié)束后，即孵化后70 d運(yùn)輸?shù)街袊?guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，暫養(yǎng)到90 d后，開(kāi)始試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)魚(yú)平均體長(zhǎng)（10.2±5.88）cm，平均體重（15.19±2.95）g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用循環(huán)水系統(tǒng)，水族箱為95 cm×50 cm×60 cm，試驗(yàn)魚(yú)經(jīng)充分暴氣3 d后的水馴養(yǎng)1周后，供試驗(yàn)用，pH保持在7.5左右，溶解氧濃度＞6.0 mg·L－1，光照為自然光源。同批魚(yú)卵孵化至90 d，按平均體長(zhǎng)、體重一致的原則，將實(shí)驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分為5個(gè)溫度處理（15，18，21，24和27℃）組，每個(gè)溫度處理組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)。采用電子溫控器控制溫度（±0.5℃）。將雌激素溶解于30%、45%、60%和75%的醫(yī)用乙醇中，配置為2 mg·mL－1的濃度，計(jì)算死亡率后選取最適乙醇濃度注射，注射濃度為0.1 ug·g－1。各試驗(yàn)組在所設(shè)定的溫度中培育30 d至孵化后120 d。各試驗(yàn)組和對(duì)照組于注射第1天、7天、15天和30天采集血漿液氮保存。對(duì)照組為相同溫度下的未注射組。養(yǎng)殖方法幼魚(yú)期投喂人工飼料，每日投喂3次，日投喂率為4%。

1.3 血漿性激素的測(cè)定方法

用注射器浸潤(rùn)肝素鈉后，于尾椎動(dòng)（靜）脈取血。血樣先注入置于碎冰中的1.5 mL塑料離心管內(nèi)，室溫放置 1 h 后，5 000 r·min－1離心 10 min，血漿入液氮中速凍后再置－20℃冰箱中保存，待測(cè)l7β－雌二醇（17β－estradiol，E2）和睪酮（Testosterone，T）含量。采用BECMAN ACESSⅡ電化學(xué)法光儀測(cè)定血漿中E2和T濃度，E2和T電化學(xué)發(fā)光試劑盒由BECMAN提供。

1.4 組織學(xué)切片制作

飼養(yǎng)試驗(yàn)30 d結(jié)束后，于120 d分別計(jì)算其成活率。采其性腺組織，Bouin′s液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色。在OLYMPUS BX51顯微鏡（配冷光源數(shù)碼相機(jī)OLYMPUS DP70）下觀察，拍照。早期性腺發(fā)育分期參照Flynn的方法[9]。通過(guò)對(duì)各組所有存活個(gè)體的性腺切片進(jìn)行觀察，確定性別，計(jì)算其雌雄比率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后采用SPSS11.0軟件對(duì)成活率和雄性率進(jìn)行t檢驗(yàn)(t－test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和注射17β-E2對(duì)施氏鱘死亡率的影響

不同溫度處理組的死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組（未注射）中，28℃處理組的死亡率顯著高于其他溫度組，而其他溫度試驗(yàn)組間的死亡率差異不顯著，均低于1%。經(jīng)激素處理后，28℃組的死亡率最高，其他組的死亡率沒(méi)有顯著的規(guī)律。由此可見(jiàn)，除高溫組外，其他溫度對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的死亡率沒(méi)有影響。

2.2 不同養(yǎng)殖溫度下注射17β-E2對(duì)施氏鱘血漿T濃度的影響

如表2所示，注射17β－E224 h后，各溫度組血漿T含量下降到0 ng·mL－1，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。注射后1～15 d各組血漿T含量均為0 ng·mL－1，一直持續(xù)到注射后 30 d，21、25 和 28℃高溫組血漿T含量開(kāi)始緩慢回升到0.33～0.41 ng·mL－1，說(shuō)明注射 17β－E2顯著降低了血漿 T 含量。總的變化趨勢(shì)是：處理后24 h后達(dá)到最低值，即各溫度組血漿T含量明顯下降到0。30 d時(shí)以高溫組開(kāi)始回升，21、24和27℃組血漿T水平與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。注射 17β－E2后，溫度同時(shí)也對(duì)施氏鱘的血漿T水平具有一定調(diào)控作用。

表1 不同溫度下注射17β-E2的死亡率Table 1 Mortality of 17β-E2injection by different temperature

表2 17β-E2注射后不同溫度下施氏鱘血清T水平的變化Table 2 Changes of serum T levels of Amur sturgeon under different temperature by 17β-E2injection

2.3 不同養(yǎng)殖溫度下注射外源雌激素對(duì)施氏鱘血漿E2濃度的影響

如表3所示，17β－E2注射后24 h血漿E2水平顯著升高，明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。注射7～15 d，血漿溫度E2水平顯著下降，以15℃組下降最慢顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），28℃組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），而18℃組、21℃組和24℃組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。注射30 d時(shí)E2水平略有回升，其中18℃組、21℃組和24℃組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），15℃組和27℃組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可以看出，注射17β－E2后，在短時(shí)間內(nèi)顯著提高了施氏鱘血漿E2水平后，隨之血漿E2水平后很快降低，不久后又開(kāi)始持續(xù)回升。總的變化趨勢(shì)是：注射17β－E224 h后，各溫度組血漿E2水平明顯升高，7 d后開(kāi)始緩慢降低，15 d后降到最低值后，開(kāi)始回升，30 d時(shí)有所回升，以21和24℃組回升最快。注射17β－E2后，溫度也對(duì)施氏鱘血漿E2水平具有一定調(diào)控作用。

表3 17β-E2注射后不同溫度下施氏鱘血清E2水平的變化Table 3 Changes of serum E2levels of Amur sturgeon under different temperature by 17β-E2injection

2.4 不同養(yǎng)殖溫度下注射外源雌激素對(duì)施氏鱘性腺分化及性別比率的影響

與對(duì)照組比，17β－E2注射的各溫度處理組的性腺外部形態(tài)結(jié)構(gòu)相同，其發(fā)育特點(diǎn)是早期性腺均為線條狀，白色，成對(duì)存在，外被一層薄的結(jié)締組織（見(jiàn)圖版Ⅰ－a）。

本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組的性腺已完成PGC細(xì)胞向性腺原基的遷移，體細(xì)胞、性原細(xì)胞和生殖上皮細(xì)胞數(shù)量迅速增加，體組織增生物向性腺腹腔凸出，形成原始性腺雛形，性腺內(nèi)血管增多（見(jiàn)圖版I－b）。低溫沒(méi)有抑制了施氏鱘性腺的早期發(fā)育（見(jiàn)圖版Ⅰ－c，d），而高溫更促進(jìn)了施氏鱘性腺的早期發(fā)育（見(jiàn)圖版Ⅰ－m，n）。激素處理組中的高溫組的性腺出現(xiàn)2種不同的表面結(jié)構(gòu)，性腺開(kāi)始分化。其中，生殖上皮光滑，不具有皺褶或生殖溝的性腺原基發(fā)育為精巢（見(jiàn)圖版Ⅰ－c，h，k，n），而生殖上皮有內(nèi)陷、褶皺和深溝的性腺原基發(fā)育為卵巢（見(jiàn)圖版Ⅰ－d，f，g，m）。注射 17β－E2和溫度能使施氏鱘的性分化時(shí)間提前，但不能改變?nèi)后w中的雌雄1∶1的性別比率（見(jiàn)表4）。

表4 溫度和外源雌激素對(duì)施氏鱘性別比率的影響Table 4 Effects of temperature and 17β-E2on sex ratios of Amur sturgeon

圖版Ⅰ 溫度和外源雌激素對(duì)施氏鱘性分化和性別比率的影響PlateⅠ Effect of temperature and estradiol-17β on sex differentiation and sex ratio of Amur sturgeon

3 討論

3.1 激素處理對(duì)死亡率的影響

研究表明，激素誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)性轉(zhuǎn)化時(shí)，處理強(qiáng)度對(duì)成活率有影響。Flynn等研究表明estradiol-17β對(duì)短吻鱘幼魚(yú)具有一定的致死作用[9]。張曉彥、Knorr和阮洪超等的研究結(jié)果表明，性激素的劑量與試驗(yàn)魚(yú)死亡率關(guān)系密切[15-17]。在本試驗(yàn)中，雌二醇濃度的濃度為0.1 μg·L-1注射處理，隨養(yǎng)殖水溫的不同出現(xiàn)了較高的死亡率。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)所使用的激素劑量對(duì)施氏鱘成活率基本沒(méi)有影響。

3.2 溫度和外源雌激素對(duì)施氏鱘血漿性激素的影響

在性激素產(chǎn)生過(guò)程中，有一系列的酶促反應(yīng)參與，高溫或低溫有可能通過(guò)芳香化酶的催化作用，最終影響?hù)~(yú)體內(nèi)雌、雄激素的產(chǎn)生[18-20]。本試驗(yàn)中，在受到外源激素的影響后，21℃組的雌激素含量恢復(fù)較快，這可能與溫度影響體內(nèi)性激素（雄激素和雌激素）的產(chǎn)生的結(jié)論相一致。溫度影響芳香化酶的表達(dá)已有試驗(yàn)證明，如對(duì)斑馬魚(yú)（Danio rerio）的研究表明，高溫誘導(dǎo)基因型雌性斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)化為表型雄性的逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，引起了卵母細(xì)胞凋亡和性腺中的芳香化酶活性降低[20-21]。此外，南方鯰（Silurus meridionalis）的人工繁殖后代全是雌性，但使用非類(lèi)固醇類(lèi)芳香化酶抑制劑（Fadrozole）處理孵化不久的幼魚(yú)可以得到高比例的雄魚(yú)，表明芳香化酶的活性可能受到了抑制，不能催化雄激素轉(zhuǎn)化成雌激素，從而使雌魚(yú)性逆轉(zhuǎn)為雄魚(yú)[22]。

注射17β-E2后，施氏鱘體內(nèi)的內(nèi)分泌平衡水平被破壞。其總的規(guī)律是不同溫度下，血漿E2的水平增加而T濃度顯著降低至0 pg·mL-1，這可能高水平的E2濃度與T濃度產(chǎn)生拮抗作用，抑制體內(nèi)T濃度的產(chǎn)生[23]。此外，對(duì)真鯛（Pagrus major）的研究表明，在一天的不同時(shí)間內(nèi)采樣測(cè)定血漿T和E2的含量，會(huì)有很大差別，血漿性類(lèi)固醇激素的分泌存在日變化節(jié)律，且與光周期有密切關(guān)系[24]。本研究中施氏鱘為底層魚(yú)類(lèi)，各組的采樣條件也均一致，因此不受采樣時(shí)間和光周期的限制。環(huán)境不適或操作脅迫均可能造成血漿T水平升高不顯著或者下降，特別是環(huán)境脅迫作用最有可能是血漿T水平下降的直接原因[24]。本試驗(yàn)中，雖然注射雌二醇后，不同溫度條件下的T濃度顯著降低至0 pg·mL-1，但隨著體內(nèi)E2的水平的變化，30 d后開(kāi)始恢復(fù)，因此不認(rèn)為是環(huán)境脅迫作用導(dǎo)致血漿T水平的顯著下降。

3.3 溫度和外源雌激素對(duì)施氏鱘性分化和性比的影響

解剖學(xué)上鱘開(kāi)始出現(xiàn)雌雄分化的時(shí)間在不同種之間差異較大。Grandi等報(bào)道納氏鱘（A.naccarii）于6月齡性腺開(kāi)始雌雄分化，俄羅斯鱘（A.gueldenstaedtii）在 3月齡、雜交鱘（Huso huso x A.ruthen）在6月齡、小體鱘（A.ruthen）在8月齡、短吻鱘（A.brevirostrum）在 7月齡、而中華鱘（A.sinensis）在 9月齡性腺開(kāi)始雌雄分化[9，25-27]。本研究中，施氏鱘在孵化后120 d還沒(méi)開(kāi)始性分化，表明施氏鱘的性腺分化時(shí)間要長(zhǎng)于俄羅斯鱘。姚道霞等人和張曉彥等人對(duì)黃顙魚(yú)和半滑舌鰨的報(bào)道表明，用17β-E2處理黃顙魚(yú)和半滑舌鰨時(shí)，雌二醇促使其卵巢提前分化，而使精巢分化推遲[15，28]。其原因可能是在魚(yú)類(lèi)性分化過(guò)程中起了關(guān)鍵作用的芳香化酶可以刺激卵巢的分化，而外源性雌激素可以顯著提高魚(yú)類(lèi)芳香化酶的產(chǎn)生[15]。因此，在魚(yú)類(lèi)性分化之前，進(jìn)行外源性雌激素處理，會(huì)促使魚(yú)體內(nèi)雌性激素的分泌量增加和雄性激素的降低，從而使魚(yú)類(lèi)的卵巢分化提前，精巢分化滯后。本研究中17β-E2和溫度處理使施氏鱘性腺均已在組織學(xué)水平上出現(xiàn)性分化，其中27℃高溫組明顯的促進(jìn)其性腺的提前發(fā)育，未觀察到精巢分化滯后的現(xiàn)象。此外，雌激素用于誘導(dǎo)產(chǎn)生雌魚(yú)，雄激素則根據(jù)劑量不同用于誘導(dǎo)雄性化或不育魚(yú)。而激素處理對(duì)性分化的影響除了正常的性轉(zhuǎn)化外，還可能使性腺出現(xiàn)畸形，如卵巢與精巢共存、精巢中出現(xiàn)卵巢腔或是性腺萎縮等[28]。本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)雌雄間體、性腺萎縮等現(xiàn)象這與半滑舌鰨性分化的組織學(xué)的研究結(jié)果一致[15]。

研究表明，CYP19可以催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，被認(rèn)為是性腺性別分化中的關(guān)鍵酶，控制著性激素的相對(duì)比率，比率的高低決定性別分化的方向[29]。溫度通過(guò)影響芳香化酶基因的表達(dá)或其調(diào)節(jié)基因的活性而最終影響性腺性別的分化[29-30]。在本試驗(yàn)中溫度和外源雌激素是否是通過(guò)影響芳香化酶，從而影響雄激素／雌激素比率來(lái)影響施氏鱘性別分化的還需要進(jìn)一步研究，但是可以肯定的是在本研究中，施氏鱘的雄激素／雌激素比率通過(guò)溫度和外源雌激素發(fā)生了顯著的改變。有研究認(rèn)為，魚(yú)類(lèi)性分化過(guò)程中芳香化酶起了關(guān)鍵作用，可以刺激卵巢的分化，而外源性雌激素可以顯著提高魚(yú)類(lèi)芳香化酶的產(chǎn)生[31-33]。

[1]謝忠明,孫大江,王京樹(shù),等.鱘魚(yú)養(yǎng)殖技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:33-35.

[2]孫大江,曲秋芝,馬國(guó)軍,等.中國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖概況叫[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,18(3):216-227.

[3]曲秋芝,孫大江,王丙乾,等.施氏鱘卵巢發(fā)育的組織學(xué)觀察[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2004,28(5):487-492.

[4]Yamazaki F.Sex control and manipulation in fish[J].Aquaculture.1983,33:329-354.

[5]Grandi G,Giovannini S,Chicca M.Gonadogenesis in early developmental stages ofAcipenser naccariiand influence of estrogen immersion on feminization[J].Journal of Applied Ichthyology,2007,3(1):3-8.

[6]Nagahama Y.Gonadal steroid hormones:major regulators of gonadal sex diferentiation and gametogenesis in fish[J].Physiol Fish Univ Bergen,2000:211-222.

[7]Van Eenennaam J P,Doroshov SI.Effects of age and body size on gonadal development ofAtlantic sturgeon[J].Fish Biol,1998,53:624-637.

[8]李璐.施氏鱘早期性腺發(fā)育研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2006.

[9]Flynn S R,Benfey T J.Sex differentiation and aspects of gametogenesis in shortnose sturgeon Acipenser brevirostrum Lesueur[J].J Fish Bio1,2007,70:1027-1044.

[10]Omoto N,Maebayashi M,Mitsuhashi E,et al.Effects of estradiol-17β and 17α-methyltestosteroneon gonadal sex differentiation in theF2hybridsturgeon,thebester[J].Fish.Sci,2002,68:1047-1054.

[11]Pandian T J,Sheela S G.Hormonal induction of sex reversal in fish[J].Aquaculture,1995,138:1-22.

[12]Shawn R.Flynn,Tillmann J.B.Effects of dietary estradiol-17β in juvenile shortnose sturgeon,Acipenser brevirostrum,Lesueur[J].Aquaculture,2007,270:405-412.

[13]Tessema M,MLLER-Belecke A,H?RSTGEN-Schwark G.Effect of rearing temperatures on the sex ratios ofOreochromis niloticuspopulations[J].Aquaculture,Amsterdam,2006,258(1):270-277.

[14]陳玉紅,林丹軍,尤永隆.泥鰍的性腺分化及溫度對(duì)性腺分化的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2007,14(1):74-82.

[15]Ito L S,Takahashi C,Yamashita M,et al.Warm water induces apoptosis,gonadal degeneration,and germ cell loss in subadult pejerreyOdontesthes bonariensis(Pisces,Atheriniformes)[J].Physiol Biochem Zool,2008,81(6):762-774.

[16]張曉彥,劉海金.17β一雌二醇對(duì)半滑舌鰨性分化和生長(zhǎng)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(6):67-72.

[17]Knott S,Braunbeck T.Decline in reproductive success,sex reversal and development alterations in Japanese medaka(Oryzias latipes)after continuous exposure to octylphenol[J].Ecotoxicology and Enviremental Safety,2002,51:187-196.

[18]阮洪超,黃瑞冬.己烯雌酚誘導(dǎo)黑鯛幼魚(yú)性轉(zhuǎn)換[J].海洋水產(chǎn),1997(6)：6-7.

[19]樓允東,吳萍.溫度在水產(chǎn)動(dòng)物性別控制中的作用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,17(4):481-485.

[20]翁幼竹,張為民,方永強(qiáng),等.1713一雌二醇誘導(dǎo)鯔魚(yú)雌性化的機(jī)制:芳香化酶和雌激素受體雙染定位研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2003,10(6):446-450.

[21]Simpson E R,Mahendroo M S,Means G D,et a1.Aromatase cytochrome P450,the enzyme resporsible for estrogen biosynthesis[J].Endocrinol Rev,1994,15:342-355.

[22]Goto Kazeto R,Kight K E,Zohar Y,et a1.Localization and expression of aromatase mRNA in adult zebrafish[J].Gen Comp Endocrinol,2004,139(1):72-84.

[23]張修月,焦保衛(wèi),吳天利,等.南方鯰性腺分化的組織學(xué)觀察[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2005,40(1)：41-48.

[24]Syaghalirwa N M,Mandiki,Igor Babiak1,et al.Effects of sex steroids and their inhibitors on endocrine parameters and gender growth differences in Eurasian perch(Perca fluviatilis)juveniles[J].Steroids,2005,70:85-94.

[25]溫海深,宋海霞,楊立廷,等.外源激素對(duì)養(yǎng)殖牙鲆血漿睪酮和雌二醇含量的影響研究[J].海洋學(xué)報(bào),2006,28(4):115-120.

[26]Akhundov M M,Fedorov K Y.Early gametogenesis and gonadogenesis in sturgeons.On criteria for comparative assessment of juvenile gonadal development in the example of the Russian sturgeon,Acipensergueldemtaedtii[J].JIchthyol,1991,31:101-114.

[27]Wrobel H H,Hees I,Schinnel M,et a1.The genus Acipenser as a model system for vertebrate urogenital development:Nephrostomial tubules and their significance for the origin of the gonad[J].Anat Embryol,2002,205:67-80.

[28]陳細(xì)華,危起偉,楊德國(guó),等.養(yǎng)殖中華鱘性腺發(fā)生與分化的組織學(xué)研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2004,28(6):633-639.

[29]姚道霞.黃顙魚(yú)性分化及激素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)化研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2007:1－56.

[30]Tsai C L,Chang S L,W an g L H,et a1.Temperature influences the ontogenetic expression of aromatase and oestrogen receptor mRNA in the developing tilapia(Oreochromis mossambicus)brain[J].J Neuroendocrinol,2003,15(1):97－102.

[31]Eric S,Alexis F.Temperature effects and genotype temperature interactions on sex determination in the European sea bass(Dicentrarchus labraxL.)[J].Journal of Experimental Zoology,2002,292:494－505.

[32]Nagahama Y.Gonadal steroid hormones：Major regulators of gonadal sex diferentiation and gametogenesis in fish[J].Physiol Fish Univ Bergen,2000，295:211－222.

[33]Pandian T J,Sheela S G.Hormonal induction of sex reversal in fish[J].Aquaculture,1995,138:1－22.