鵝源H5N1亞型禽流感病毒對SPF雛雞血液免疫功能的影響

鄭世民，王濱坤，高雪麗，劉超男，劉 明，呂曉萍

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.上海恒豐強動物藥業有限公司，上海 201620；3.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，哈爾濱 150001）

禽流感（Avian influenza，AI）是一種急性熱性接觸性傳染病[1-2]，流行范圍很廣，尤其近年AI疫情呈現上升趨勢，給主要養禽國家造成巨大經濟損失[3]，自上世紀90年代香港禽流感事件以來[4]，AI的公共衛生學意義發生了質的改變，AI不但得到廣大學者的關注，而且已引起了包括聯合國在內的世界各國政府的高度重視。縱觀對AI已有的研究資料，主要集中在病原學、流行病學、特異性診斷、DNA序列分析和疫苗研制等方面[5-7]。在宿主抗AIV免疫反應機制方面，只見于人和小鼠的少量報道[8-9]，對SPF雛雞感染AIV后外周血液體液免疫和細胞免疫變化的全面系統研究尚未見報道。因此，本項目以21日齡SPF雛雞為研究對象，應用細胞培養技術、免疫酶組織化學等方法，對AIV感染21日齡SPF雛雞外周血IgG、IgM和IgA含量，T、B淋巴細胞數量及其對ConA或PMA的增殖反應進行了較全面系統的檢測，旨在為進一步探討流感病毒的免疫致病機制，為其獸醫臨診綜合防治提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

21日齡CSIRO-MVS品系SPF雛雞70只，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所SPF實驗動物中心提供并飼養。

1.1.2 禽流感病毒（AIV）

鵝源H5N1亞型AIV中強毒株，血凝價為26，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家禽流感參考實驗室提供，并監督使用。

1.1.3 主要試劑

酶標羊抗兔IgG結合物（HRP-SARIgG），北京中山生物制品公司產品；兔抗雞IgG、IgM、IgA血清（RACIgS），本研究室制備；刀豆蛋白A（ConA）、乙酸豆寇佛波醇（PMA）、RPMI1640完全培養液和四甲基偶氮唑鹽（MTT）均為Sigma公司產品，按實驗要求配成相應使用液，4℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

70只SPF雛雞隨機分為AIV感染組（簡稱I組）和對照組（簡稱C組），每組35只雛雞。其中I組雛雞經點眼、滴鼻和口感染1∶100稀釋的AIV稀釋液0.1 mL·只-1；C組雛雞經上述相同途徑給予高壓消毒的 0.01 mol·L-1PBS 0.1 mL·只-1，兩組雛雞分別飼養于禽病感染實驗室的負壓隔離器內，嚴格按照高致病性禽流感實驗要求和SPF動物飼養規程飼養管理。

1.2.2 被檢材料

兩組雛雞分別于AIV感染后1、3、4、5、8、14和21 d，每組隨機抽取5只雛雞，心臟采血2 mL供外周血液T、B淋巴細胞數量及其增殖功能檢測，然后心臟采血處死雛雞，收集0.5 mL血清供IgG、IgM、IgA檢測用。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 外周血液T、B淋巴細胞數量測定

采用免疫SPA菌體花環法。

1.3.2 血清IgG、IgM、IgA含量測定

采用間接酶聯免疫吸附試驗（Indirect enzymelinked immunosor-bent assay，iELISA）法。

1.3.3 外周血液T、B淋巴細胞增殖功能測定

1.3.3.1 淋巴細胞懸液制備

無菌采取外周血液，以淋巴細胞分離液密度梯度離心法（2 000 r·min-1，20 min）分離淋巴細胞，再用RPMI1640培養液離心洗滌（1 500 r·min-1，10 min）淋巴細胞3次，臺盼蘭拒染法檢測細胞活率＞95%，并進行細胞計數，用RPMIl640完全培養液調細胞濃度至 2×107個·mL-1。

1.3.3.2 T、B淋巴細胞增殖功能測定——細胞培養及MTT法

96孔微量培養板，每孔加入50 μL含ConA（80 μg·mL-1ConA）或 PMA（1 200 ng·mL-1PMA）的RPMI1640完全培養液，對照孔只加RPMI1640完全培養液，再加淋巴細胞懸液50 μL，培養物總體積為 100 μL，細胞終濃度為 1×107個·mL-1，刺激孔的ConA、PMA終濃度分別為40、600 ng·mL-1，對照孔無ConA或PMA，每組設3個重復。細胞培養板置40℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養21 h。然后每孔加5mg·mL-1MTT溶液10μL，再繼續培養3h。每孔加入 10%SDS-0.01 mol·L-1HCl溶液 100 μL，置細胞培養箱中8 h，然后取出以空白孔調零。測定每孔OD590的OD值，結果以淋巴細胞轉化率表示。

T、B淋巴細胞轉化率=ConA或PMA刺激孔平均OD值/對照孔平均OD值

1.4 數據處理

應用Minitab軟件進行數據統計處理，經t檢驗分析組間差異。

2 結果與分析

2.1 AIV感染21日齡SPF雛雞血液體液免疫功能變化

2.1.1 AIV感染21日齡SPF雛雞血清免疫球蛋白含量的動態變化

21日齡SPF雛雞感染AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后1～4 d明顯低于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01），第5天后開始逐漸升高，8～21 d顯著高于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01）；IgM含量于第4天開始增加，5～8 d顯著或極顯著高于對照雛雞（P＜0.05或P＜0.01）；而IgA含量在病毒感染后4 d內顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），5～8 d病毒感染雛雞較對照雛雞明顯增加（P＜0.05），其余未見統計學差異（見表 1）。

2.1.2 AIV感染21日齡SPF雛雞外周血液B淋巴細胞數量及其對PMA增殖功能變化

21日齡SPF雛雞感染AIV后，其外周血液B淋巴細胞數量除第1天明顯高于對照雛雞（P＜0.05）外，3～14 d均顯著或極顯著（P＜0.05或 P＜0.01）低于對照雛雞；B淋巴細胞對PMA的增殖反應于病毒感染后 3～8 d明顯減弱（P＜0.05或 P＜0.01），其他除第1天外，其余盡管病毒感染雛雞較對照雛雞增加，但未見統計學差異（P＞0.05）（見表 2）。

表1 AIV感染21日齡SPF雛雞血清免疫球蛋白含量變化Table 1 Changes of the immunoglobulin（Igs）content in serum of 21-day-old chickens infected with AIV （OD492）

表2 AIV感染21日齡SPF雛雞血液B淋巴細胞數量及其增殖反應變化Table 2 Changes of the number and proliferative responses to PMA of B lymphocytes in blood of 21-day-old chickens infected with AIV

2.2 AIV感染SPF雛雞外周血液細胞免疫功能變化

21日齡SPF雛雞感染AIV后1～14 d，其外周血液T淋巴細胞數量較對照雛雞顯著或極顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；T淋巴細胞對ConA的增殖反應于病毒感染后3～14 d明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其余未見統計學差異（見表3）。

表3 AIV感染21日齡SPF雛雞血液T淋巴細胞數量及其對ConA增殖反應變化Table 3 Changes of the number and proliferative responses to ConA of T lymphocytes in blood of 21-day-old chickens infected with AIV

3 討 論

本研究應用細胞培養技術和免疫酶組織化學方法對21日齡SPF雛雞人工感染鵝源H5N1亞型中強毒AIV后，其外周血液的IgG、IgM、IgA含量，T、B淋巴細胞數量及其對ConA或PMA增殖功能的動態變化進行動態檢測，結果發現，21日齡SPF雛雞感染H5N1亞型AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后1～4 d明顯低于對照雛雞，隨后開始逐漸升高；IgM含量于5～8 d顯著或極顯著高于對照雛雞；而IgA含量在病毒感染早期顯著降低，5～8 d較對照雛雞明顯增加。外周血液B淋巴細胞數量于病毒感染后3～14 d顯著或極顯著低于對照雛雞；B淋巴細胞對PMA的增殖反應于病毒感染后3～8d明顯減弱。表明AIV感染雛雞外周血液的體液免疫功能受到一定程度抑制。據報道[10]，雞自然感染AIV后第3天已有HA特異性抗體的產生，并且可維持較高水平。在抵御流感病毒感染中，以B淋巴細胞為主的體液免疫發揮了十分重要的作用。B淋巴細胞在致敏Th細胞及其分泌的某些細胞因子（如IL－1、B細胞生長因子、B細胞分化因子、IL－2等）作用下，分化發育為漿細胞，分泌T細胞依賴性（TD）抗體。Walter等研究發現[11]，T淋巴細胞缺陷小鼠流感病毒感染后也可誘導抗體反應，表明流感病毒可不依賴于T細胞輔助抗體應答，稱為T細胞非依賴性（TI）抗體應答，該抗體通常只產生IgM型抗體，而且不發生抗體類別轉換，且無記憶反應。進一步研究表明，上述兩種抗體均能在一定程度上降低流感病毒感染動物的死亡率，但TD抗體對機體的保護比TI抗體更有效[12]。Kostolansky等試驗發現[13]，小鼠自然感染AIV后，可引起強烈的抗HA2抗體應答，表明AIV的HA2可誘導機體產生清除病毒的抗體。

本研究還發現，21日齡SPF雛雞感染AIV后，其外周血液T淋巴細胞不但數量較對照雛雞顯著或極顯著減少，而且T淋巴細胞對ConA的增殖反應于病毒感染后3～14 d也明顯降低，表明AIV感染可顯著降低SPF雛雞外周血液的細胞免疫功能。王穎彥等報道[9]，感染H5N1病毒小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞數量下降，脾臟中T細胞數量下降趨勢與血液相同，AIV感染對T淋巴細胞數量影響較大，特別是CD8+T淋巴細胞受損害更為明顯。另有研究發現[14]，在AIV感染急性期T、B淋巴細胞數量均減少，但不改變CD4+與CD8+T細胞比率，T淋巴細胞對PHA和ConA的應答降低，表明AIV可抑制細胞免疫功能。雞、雉雞人工或自然感染高致病性禽流感病毒后，其胸腺、法氏囊和脾臟等器官均呈現壞死性炎[15－17]，由于病毒感染使免疫器官發生變性、壞死，不但導致淋巴細胞數量明顯減少，而且淋巴細胞對有絲分裂原的應答功能也顯著降低。本項目的另一部分研究也發現[18]，AIV感染SPF雛雞后，其胸腺、法氏囊和脾臟等免疫器官的T、B淋巴細胞對ConA或PMA的增殖反應在一定時間內明顯下降，但兩者的程度并不相同，其中T淋巴細胞對有絲分裂原的反應性較B淋巴細胞降低尤為明顯。AIV感染SPF雛雞后，其外周血液的細胞免疫和體液免疫功能下降是機體免疫器官免疫功能低下的外在表現，而免疫器官免疫功能的減弱或喪失是外周血液免疫功能改變的基礎或根源。

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