J亞群禽白血病病毒gp85單抗1E3株抗原識別表位的初步分析

莫虹斐，余 多，孫 淼，陳福勇，曹 紅

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100）

J亞型禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一種以成髓細胞增生、免疫抑制、生長發育受阻為特點的傳染性腫瘤疾病［1-2］，于1988年由英國的Payne博士［3］等首次發現。該病近年來在我國的發病率呈逐年上升趨勢。ALV-J基因組主要含有3個基因，即gag、pol和env，其中env基因編碼的囊膜表面蛋白gp85是病毒抗原的主要成分，決定病毒亞群特異性和宿主范圍［4］。2000年，秦愛建、崔治中等［5］首次在國內研制了抗J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特異性單克隆抗體，并分析了其識別的ALV-J囊膜糖蛋白的分子量為90～94kD，識別的未糖基化的囊膜蛋白分子量約為53kD；2003年，楊玉瑩、秦愛建等［6］首次克隆表達了gp85基因，證明gp85蛋白具有病毒的抗原特異性。但目前國內外尚無ALV-J gp85單克隆抗體識別的具體表位的相關報道。

本試驗為了初步確定ALV-J gp85單克隆抗體1E3株所識別的抗原位點，將S1株的gp85基因進行了分段克隆表達，并通過免疫印跡的方法進行分析，結果發現1E3株單抗識別的抗原表位位于gp85蛋白N端第69至112個氨基酸之間。此項研究為進一步分析ALV-J中國分離株S1的抗原性變異及gp85蛋白的抗原表位所在位點奠定了基礎，為建立以表位為基礎的抗原抗體診斷方法提供了必要的物質材料支持，對于深入了解ALV-J的亞群特性、致病機理以及診斷和預防均具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒 感受態細胞DH5α及BL21購于北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，原核細胞表達載體pGEX-6p-1、重組質粒pET-28a-J gp85，均為本實驗室保存。

1.2 主要試劑及試劑盒 ALV-J S1gp85特異性單克隆抗體1E3株，為本實驗室制備；限制性內切酶Bam HⅠ、XhoⅠ、10×K Buffer，購自 TaKaRa公司；Taq plus DNA聚合酶、10×PCR Buffer、HRP標記的羊抗鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；dNTPs、IPTG，購自北京盛旭百川生物科技有限公司；抗GST標簽小鼠單克隆抗體、高靈敏化學發光檢測試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司；高純度質粒小量提取試劑盒，購自北京威格拉斯生物技術有限公司；DNA純化與濃縮-25試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒，均購自Zymo Research公司。

1.3 基因片段的初次分段亞克隆 對重組表達質粒pET-28a-J gp85進行測序及同源性分析，根據ALV-J S1株病毒gp85基因序列，設計兩對特異性引物A和B，用于擴增gp85基因A片段（1～687 bp）和B片段（337～921bp），在上、下游引物中分別引入酶切位點Bam HⅠ和XhoⅠ（下劃線），同時還加入保護性堿基和終止密碼子。擴增產物經1%DNA瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 重組原核表達質粒pGEX-6p-1-J gp85-A、pGEX-6p-1-J gp85-B的構建 PCR產物經過回收和純化，用限制性內切酶Bam HⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，同時表達載體也進行雙酶切。將目的基因和載體用SolutionⅠ酶連接，構建成重組質粒，轉化入感受態細胞DH5α并進行擴增培養，挑取單個菌落并提取質粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將雙陽性質粒送檢測序。陽性重組質粒轉化入感受態細胞BL21，構建基因重組表達工程菌。

1.5 重組蛋白的誘導表達和Western-blot鑒定37℃振搖培養工程菌，至OD600＝0.4～0.6時加入IPTG誘導表達4h，重組蛋白進行SDS-PAGE電泳1h，產物經4℃、100V、200mA恒流轉印1h至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉8h，經PBST洗滌3次后，分別以抗GST標簽鼠單克隆抗體和ALV-J gp85單抗1E3株為一抗，室溫下孵育1h，PBST洗滌6次。以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫下孵育30min，PBST洗滌6次。最后滴加適量發光液，曝光1～10min，標記并保存膠片。

1.6 基因片段A的分段亞克隆、表達及鑒定 根據其片段A的基因序列，設計兩對特異性引物，分別用于C片段（1～204bp）和D片段（115～336bp）的擴增和克隆。擴增產物經1%DNA瓊脂糖凝膠電泳分析。

PCR產物經回收、連接后構建重組表達質粒pGEX-6p-1-J gp85-C、pGEX-6p-1-J gp85-D。鑒定后，按照前述方法進行誘導表達和Western-blot鑒定（轉印40min、曝光1～3min）。

2 結果

2.1 實驗室保存的ALV-J S1株gp85基因核苷酸長度為921bp，編碼307個氨基酸。經測序比對，與已發表的NX0101株的gp85基因核苷酸序列同源性為96%，發生了22個氨基酸點突變，在118處缺失一個組氨酸（H）。

2.2 ALV-J gp85-A、ALV-J gp85-B重組質粒的構建 通過PCR技術亞克隆了gp85-A和gp85-B基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，與預期大小相符（圖1）。

2.3 重組蛋白gp85-A、gp85-B的SDS-PAGE分析 預期重組蛋白gp85-A大小為51kD，gp85-B為48kD。經SDS-PAGE結果表明，重組菌誘導后在45kD處出現一條較粗的蛋白條帶，大小與目的蛋白的理論值相符，初步確定為重組蛋白。空載體誘導后在約25kD處出現一條較粗的蛋白條帶，初步確定為GST標簽蛋白。而空載體、重組菌的不誘導對照組的相應位置處均無相應條帶（圖2）。

2.4 重組蛋白gp85-A、gp85-B的Western-blot分析 重組蛋白與抗GST標簽鼠單克隆抗體反應的Western-blot結果可見，重組蛋白在蛋白質Marker的50kD處出現特異帶，空載體標簽蛋白在大約26 kD處出現條帶（圖3）。

圖3 重組蛋白的Western-blot分析

重組蛋白與ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株反應的Western-blot結果可見，gp85-A蛋白出現特異帶，而gp85-B、空載體標簽蛋白沒有出現任何條帶（圖4）。證明僅有gp85-A蛋白可以被ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株所識別。

圖4 重組蛋白與gp85單抗1E3株的Western-blot分析

2.5 ALV-J gp85-C、ALV-J gp85-D重組質粒的構建 通過PCR技術亞克隆了gp85-C和gp85-D基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，與預期大小相符（圖5）。

圖5 基因片段gp85-C、gp85-D的PCR產物電泳圖

2.6 重組蛋白gp85-C、gp85-D的SDS-PAGE分析 預期重組蛋白gp85-C大小為33kD，gp85-D為34kD。經SDS-PAGE結果表明，重組菌誘導后在25～35kD之間有一條較粗的蛋白條帶，大小與目的蛋白的理論值相符，初步確定為重組蛋白。空載體誘導后在約25kD處出現一條較粗的蛋白條帶，初步確定為GST標簽蛋白。而空載體、重組菌的對照組（不誘導）的相應位置處均無相應條帶（圖6）。

2.7 重組蛋白gp85-C、gp85-D的 Western-blot分析 重組蛋白與抗GST標簽鼠單克隆抗體反應的Western-blot結果可見，重組蛋白在大約蛋白質Marker的35kD處出現特異帶，空載體標簽蛋白在大約26kD處出現條帶（圖7）。

重組蛋白與ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株反應的Western-blot結果可見，gp85-D蛋白出現特異帶，而gp85-C沒有出現任何條帶（圖8）。證明僅有gp85-D蛋白可以被ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株所識別。

圖8 重組蛋白與gp85單抗1E3株的Western-blot分析

2.8 抗原表位初步分析 為了初步確定ALV-J gp85單抗1E3株所識別的抗原位點，我們用ALV-J S1gp85單克隆抗體1E3株對重組表達蛋白進行Westem-blot分析。從試驗結果可以看出，初次亞克隆中，僅gp85-A蛋白被單抗識別，反應出現了特異條帶，而gp85-B蛋白則沒有，結合兩者的氨基酸序列，gp85-A蛋白包含了第1～229個氨基酸，gp85-B蛋白包含了第112～307個氨基酸，說明該株gp85單抗的抗原表位可能在第1～112個氨基酸之間，對應的核苷酸序列為1～336bp。再次亞克隆時，針對gp85基因的1～336bp核苷酸序列進行分段，試驗結果表明，gp85-C未出現任何條帶，而gp85-D則被單抗識別，出現了特異條帶，結合兩者的氨基酸序列，gp85-C蛋白包含了第1～68個氨基酸，gp85-D蛋白包含了第38～112個氨基酸，因此，最終結果表明，ALV-J S1gp85單抗1E3株的抗原表位可能在第69到112個氨基酸（N端）之間，對應的核苷酸序列為205～336bp。

3 討論

3.1 ALV-J表型的決定因素是位于病毒表面，與宿主細胞受體作用的囊膜蛋白gp85，本試驗利用國內分離的ALV毒株，采用PCR技術成功分段擴增了ALV-J的gp85基因，利用pGEX-6p-1載體在BL21中成功表達了該基因，SDS-PAGE及 Western-blot結果表明，表達的目的蛋白大小與預期相符，具有反應原性。重組蛋白gp85-A、gp85-D經Western-blot檢測表明，具有gp85單抗1E3株可識別的抗原表位。本試驗初步研究了ALV-J囊膜蛋白gp85的抗原決定簇，為進一步研究中國株ALVJ gp85的抗原性變異及gp85蛋白的抗原表位所在位點奠定了基礎，并為進一步研制針對 ALV-J gp85蛋白的快速檢測試劑盒提供了有力的工具。

3.2 本試驗是為了分析gp85蛋白單抗識別的抗原表位，這就需要重組蛋白具有較大的表達量，而非易于提純的特點。pGEX載體表現氨芐青霉素抗性，其特點是在載體上接上了一種26kD的谷胱甘肽s-轉移酶基因，這使得表達后的融合蛋白上含有1個26kD的GST標簽蛋白［7］，可增大重組蛋白的質量，易于在電泳時觀察和分析結果。

3.3 決定抗原表位的3個主要因素即親水性、抗原指數和表面可能性，由ALV-J S1分離株gp85蛋白的氨基酸序列的抗原表位預測結果表明，可能存在著6個極有可能構成抗原表位的區域，其位置分別在第80～90個、第90～100個、第110～120個、第140～150個、第180～200個、第300～307個氨基酸之間。本試驗的結果符合以上預測。

［1］殷震，劉景華.動物病毒學［M］.北京：科學出版社，1997：870-885.

［2］喬彥華.J亞群禽白血病病毒gp85基因的克隆、原核表達及初步應用［D］.北京：中國農業大學碩士論文，2008.

［3］Payne L N，Brown S R，Bumstead N，et al.A novel subgroup of exogenous avain leucosis virus in Chicken［J］.Journal of General Virology，1991，72：801-807.

［4］Calanek B W.禽病學［M］.高福，蘇敬良，譯.北京：中國農業出版社，1999：529-559.

［5］秦愛建，崔治中，LEE LUCY，等.抗J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特異性單克隆抗體的研制及其特性［J］.畜牧獸醫學報，2001，32（6）：556-562.

［6］楊玉瑩，秦愛建，趙振華，等.J亞群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆與表達［J］.中國獸醫科技，2003，33（7）：3-6.

［7］周宇荀，魏東芝，王二力.融合蛋白表達載體pGEX及其應用［J］.生命科學，1998，10（3）：122-124.