廣東地區(qū)發(fā)病豬群豬鏈球菌感染監(jiān)測及藥敏試驗(yàn)

臧瑩安，盧 頔，胡 波，宋 帥，李 淼，李春玲

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科學(xué)系，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東 廣州 510640）

豬鏈球菌病（Swine streptococcsis）是由多種鏈球菌感染引起的危害養(yǎng)豬業(yè)的一種國家規(guī)定的二類動物疫病。鏈球菌雖然抵抗力不強(qiáng)，但由于抗生素的濫用，易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗［1-2］。所以，本試驗(yàn)通過對廣東部分地區(qū)發(fā)病豬群豬鏈球菌可疑菌進(jìn)行分離鑒定，進(jìn)而對其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為各豬場合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，購自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；基因擴(kuò)增儀，購自杭州博日科技有限公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購自北京市六一儀器廠；紫外透射分析儀，購自珠海星馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑 新生牛血清，托-休二氏液體培養(yǎng)基（THB），托-休二氏體培養(yǎng)基（THA），細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，藥敏紙片和質(zhì)控菌株，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 18～20g雄性昆明系小鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將疑似豬鏈球菌菌株S1～S20接種在THB培養(yǎng)基中，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h后，在超凈工作臺中采用劃線分離培養(yǎng)法用接種環(huán)挑取菌液接種于血平板上，37℃培養(yǎng)14～16h，經(jīng)培養(yǎng)無雜菌者，選取α溶血、光滑圓形、半透明、直徑1～2mm的小菌落，每個樣品挑去3～6個疑似菌落，分別接種3mL THB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～18h后，仔細(xì)觀察分離菌經(jīng)培養(yǎng)后的生長情況，并挑取單個可疑菌落和液體培養(yǎng)物分別作革蘭染色鏡檢。

1.5 生化特性分析 無菌操作，用移液槍分別吸取上述的各分離菌液各100μL于3mLTHB培養(yǎng)液中，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h后，分別做生長基水解試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照紙片擴(kuò)散法［8］操作。對照質(zhì)控菌株接種于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)OD600值在0.08～0.1左右時進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。

1.7 動物試驗(yàn) 將70只清潔級小鼠平均分為7組，其中一組為生理鹽水對照組。隨機(jī)抽取6個分離株先接種普通血平板，37℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種含5%犢牛血清的THB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h。各菌平板法計(jì)數(shù)后，調(diào)整菌液濃度至3×108CFU／mL。每組腹腔接種0.5mL／只。觀察記錄小鼠臨床發(fā)病和死亡情況，若出現(xiàn)小鼠死亡，立即剖檢。用接種環(huán)沾取死亡小鼠心臟、肺和肝臟在血平板上劃線，經(jīng)培養(yǎng)無雜菌者，挑取單個菌落接種于THB培養(yǎng)液中培養(yǎng)16～18h后，仔細(xì)觀察分離菌的生長情況，并對液體培養(yǎng)物做PCR檢測。

1.8 PCR檢測 本試驗(yàn)采用的引物序列（5′-3′）是CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT，GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA。片段大小為294 bp。兩個特異性PCR擴(kuò)增均采用25μL反應(yīng)體系。在反應(yīng)管中依次加入10×PCR Buffer 2.5μL、25 mmol／L MgCl22.0μL、2.5mmol／L dNTPs 2.0 μL、10pmol／μL 引物各0.5μL、模板1.0μL、5 U／μLTaq酶0.15μL，再加ddH2O調(diào)整終體積至25μL。最后置于PCR擴(kuò)增儀中經(jīng)94℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，94℃30s，60℃1min，72℃1.5min，35個循環(huán)后72℃保溫10min。同時設(shè)陰、陽性對照。將得到的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，紫外燈下照相記錄。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 可觀察到該菌溶血，呈直徑1～2mm的圓形、微突、表面光滑濕潤、小菌落形式存在。革蘭染色后呈紫色。在液體培養(yǎng)基中呈長鏈狀，一般由8～15個球菌排成鏈狀，無鞭毛，無芽孢，不運(yùn)動，無莢膜，無兩極著色現(xiàn)象。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 鑒定的菌株生化特性穩(wěn)定。菌株對蔗糖、乳糖、淀粉、pH值9.6肉湯、葡萄糖磷酸鹽胨水等易發(fā)酵，對棉子糖、蕈糖、果糖等糖類的發(fā)酵，菌株間有差異；對硫化氫、馬尿酸鈉、枸櫞酸鹽等無機(jī)鹽類物質(zhì)及6.5%高鹽肉湯、40%膽汁肉湯、蛋白胨水等不發(fā)生反應(yīng)。

表1 分離菌株生化反應(yīng)

2.3 動物試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 臨床癥狀 攻毒后24h，小鼠表現(xiàn)為被毛松亂，精神委靡，行動遲緩，食欲減退，喜趴伏，聚堆，有的小鼠表現(xiàn)呼吸加快、消瘦等癥狀。死亡的小鼠全身多個器官充血、淤血，肝臟，肺臟、腎臟等腫大，有黏性滲出物。生理鹽水對照組未出現(xiàn)小鼠死亡。

2.3.2 細(xì)菌分離和PCR鑒定 死亡小鼠體內(nèi)肺臟、心、肝臟都可以分離到細(xì)菌，細(xì)菌菌落形態(tài)與接種菌一致，經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，20株典型鏈球菌分離株中大部分對阿莫西林敏感，對先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ等藥物中度敏感，對乙酰螺旋霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、潔霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素產(chǎn)生了耐藥性。個別菌株產(chǎn)生了非常普遍的耐藥性。

表2 20株豬鏈球菌分離菌的耐藥情況

3 討論

本試驗(yàn)通過分離細(xì)菌的形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、PCR檢測、動物試驗(yàn)等進(jìn)行可疑菌的綜合判定，結(jié)果表明，此20株分離菌均為豬鏈球菌。豬鏈球菌的生化特性穩(wěn)定，發(fā)病豬群分離株沒有明顯差別，不同菌株對于個別糖類有利用的區(qū)別。生化指標(biāo)可作為細(xì)菌鑒定的一個參考。同時也佐證了PCR方法作為細(xì)菌鑒定方法的準(zhǔn)確性、精確性。

本試驗(yàn)對從廣東部分地區(qū)發(fā)病豬分離到的20株菌株進(jìn)行了13種抗生素的耐藥性檢測，90%～100%的菌株對于大環(huán)內(nèi)酯類／林可胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類都有耐藥性，而部分菌株對青霉素類、頭孢類敏感。85%的菌株對于阿莫西林中度敏感。

根據(jù)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2005年對從四川不同地區(qū)病死豬體內(nèi)分離得到的豬鏈球菌2型的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，7個菌株對四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素和鏈霉素耐藥，對于阿米卡星、新霉素和慶大霉素中度敏感，而對于青霉素、頭孢類、氟喹諾酮類、氯霉素類藥物等敏感［3-4］。Marie等分別檢測了1996～2001年間從法國臨床病豬或者不同國家病人體內(nèi)分離的共135株豬鏈球菌對于臨床常用的13種抗菌藥物的耐藥性，檢測結(jié)果表明，幾乎所有的菌株都對青霉素G、阿莫西林、頭孢噻呋、氟苯尼考、慶大霉素、桿菌肽鋅敏感，耐藥性最為嚴(yán)重的是多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類以及林可胺類抗生素，僅有幾株菌株出現(xiàn)對鏈霉素和卡那霉素的高水平耐藥［5］。可以看出，豬鏈球菌在不同國家和地區(qū)的耐藥性具有一定的差異，但是基本上對于青霉素類、頭孢類都表現(xiàn)為高度敏感，而對于大環(huán)內(nèi)酯類／林可胺類、磺胺類和四環(huán)素等的耐藥性則較為嚴(yán)重。目前，人們對豬鏈球菌的耐藥機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。PCR檢測結(jié)果表明，耐藥性的產(chǎn)生主要是細(xì)菌核糖體甲基化的結(jié)果［6-7］。研究表明，細(xì)菌長時間承受著多種抗生素選擇的壓力，因此，只有攜帶多種耐藥決定子的細(xì)菌才得以生存，這些耐藥決定子一般位于轉(zhuǎn)座子中，可在不同菌種、菌株間傳遞，造成細(xì)菌對抗生素的普遍交叉耐藥［9-10］。不同地區(qū)的耐藥情況有差別，而地區(qū)上相近的分離株的抗生素抗性和多重耐藥性均較為相似。這可能是豬場地理位置較近，有利于耐藥菌株傳播造成的。從豬場管理和耐藥性分布情況來看，管理越規(guī)范、衛(wèi)生和隔離條件越好的豬場其菌株的分離數(shù)越少，分離株的耐藥性情況也越低。所以，豬場的管理能力、衛(wèi)生隔離條件、豬源等都可能影響豬的帶菌程度和菌株耐藥性變化。

［1］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

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