大黃多糖超聲波提取工藝及抗新城疫病毒活性試驗

王春花，付云威，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學(xué)院制藥工程系，黑龍江 牡丹江 157000；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

中藥大黃（Rheum tanguticum Maxim.）為蓼科植物的根莖，成分豐富，20世紀(jì)大黃的研究主要集中于蒽類，近年研究發(fā)現(xiàn)，曾被忽視的成分大黃多糖（rheum tanguticum polysaccharide，RTP）具有廣泛的生物活性，大黃多糖具有降血糖、治療結(jié)腸炎、腦保護、抗腫瘤、增強免疫力及降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的作用。但大黃多糖提取優(yōu)化工藝的試驗報道少，超聲波提取工藝的試驗仍為空白，并且其抗病毒活性研究報道也甚少。新城疫是對養(yǎng)雞業(yè)危害較嚴(yán)重的傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，而目前能有效低毒的防治新城疫病毒性疾病的藥物缺乏。本試驗以大黃多糖為研究對象，對大黃多糖超聲波法提取工藝進行優(yōu)化，并對純化后大黃多糖的抗新城疫病毒活性進行觀察試驗，確定了大黃多糖最佳提取工藝，為防治新城疫病毒性疾病提供科學(xué)依據(jù)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與病毒 唐古特大黃購于哈爾濱世一堂藥店；病毒唑購于東北制藥總廠；所用試劑均為國產(chǎn)分析純；F9E48新城疫病毒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽病實驗室提供；9周齡SPF雞胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.2 多糖含量測定方法［1］采用苯酚-硫酸法對多糖含量進行測定，多糖提取率及含量的換算公式如下：

多糖占粗提物的比率（多糖提取率）=糖重量（經(jīng)OD值換算）／多糖測樣質(zhì)量×100%

中藥中多糖含量（多糖含量）=多糖提取率×提取粗多糖重量／中藥總重量×100%

1.3 傳統(tǒng)法提取大黃多糖 準(zhǔn)確稱取5g大黃（大黃提取前需經(jīng)干燥粉碎，回流提取，過濾干燥處理），分3次加蒸餾水達(dá)樣品量的20倍、10倍、10倍，各蒸煮1h，合并提取液過濾、濃縮和醇沉，干燥得大黃多糖，稱重，計算多糖提取率和多糖含量。

1.4 大黃多糖超聲波法提取工藝的優(yōu)化 以提取時間、溫度、料液比、pH 值為單因素考察對象（表1），以多糖含量及多糖提取率為多糖提取效果指標(biāo)，優(yōu)化超聲波法提取大黃多糖的單因素參數(shù)。采用正交試驗法優(yōu)化提取工藝（表2）。將最優(yōu)提取參數(shù)下大黃多糖提取與傳統(tǒng)提取方法比較。

表1 單因素考察

表2 正交設(shè)計試驗因素水平

1.5 大黃多糖抗新城疫病毒活性檢測 本試驗選擇體外跟蹤法，以雞胚成纖維細(xì)胞為平臺對大黃多糖抗新城疫病毒進行研究，細(xì)胞培養(yǎng)方法參照殷震［2］，接種倍比稀釋NDV病毒液，培養(yǎng)，觀察記錄，根據(jù)Reed-Muench公式計算TCID50值。

設(shè)定兩種加藥方式，先加大黃多糖再作用病毒組與先作用病毒后加多糖組，測定多種多糖對新城疫病毒的影響。細(xì)胞病變（CPE）、紫外吸光度值（OD值）及選擇指數(shù)（TI）比較法綜合評價抗病毒效果，TI=最大無毒濃度／最小有效濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對多糖提取的影響 見圖1～4。

圖1 提取時間的影響

2.2 超聲波法正交設(shè)計試驗結(jié)果 見表3～5。

表3 超聲波法提取大黃多糖正交設(shè)計試驗因素水平L9（34）

根據(jù)R值，影響多糖提取率及多糖含量的主次關(guān)系依次是溫度（C）＞料液比（B）＞pH值（A）＞時間（D）；料液比（B）＞pH 值（A）＞溫度（C）＞時間（D）。方差分析顯示，B因素及A因素即料液比和pH值對多糖含量試驗結(jié)果影響顯著。綜合考慮正交試驗結(jié)果，推定超聲波提取大黃多糖的最佳工藝條件是A3B3C1D2，即pH值為9.0，料液比為1∶40，溫度為40℃，時間為50min。條件下提取率及多糖含量為42.27%，13.11%，均高于傳統(tǒng)提取法38.10%，5.06%。

表4 超聲波法提取正交試驗結(jié)果

表5 超聲波法正交試驗方差分析

2.3 大黃多糖抗NDV作用結(jié)果

2.3.1 TCID50與大黃多糖安全濃度 NDV的TCID50為10-6.56，大黃多糖的安全濃度為1mg／mL。

2.3.2 大黃多糖抗NDV活性結(jié)果 大黃多糖抗NDV活性的細(xì)胞病變觀察結(jié)果與MTT測定結(jié)果一致，多糖濃度為1／21mg／mL，抗病毒作用最大，與病毒對照組差異極顯著（P＜0.01），抗NDV活性低于陽性對照藥，治療指數(shù)均達(dá)4，體外試驗表現(xiàn)一定細(xì)胞保護作用和抗NDV作用（見表6）。

3 討論

根據(jù)大黃藥材目的多糖高溫易變性的特點，通過先粉碎中藥再超聲波提取的方法，可低成本獲得高含量、高穩(wěn)定性、低雜質(zhì)的大黃多糖。試驗發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)提取液酸堿度可促進大黃多糖的浸出，堿度越大，大黃多糖含量越高，結(jié)合趙燕等［3］阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸5種單糖組成推測，此現(xiàn)象是由于大黃多糖中含有糖醛酸及酸性多糖所導(dǎo)致，但堿濃度過高會導(dǎo)致有些多糖在水解，不利于活性的研究。試驗發(fā)現(xiàn)，多糖顏色與提取pH值呈正相關(guān)，pH值越大顏色越深，這是由于大黃色素更易溶于堿性溶液中，pH值的增高促進了大黃中色素的溶解，增加了后期除色素的困難。

表6 RTP和sRTP各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

超聲波提取大黃多糖的最佳工藝條件為pH值9.0，料液比1∶40，溫度40℃，時間50min，這一推定參數(shù)沒在正交試驗表中，后經(jīng)驗證，參數(shù)下提取大黃多糖提取率及多糖含量為42.27%，13.11%，均高于正交試驗組與傳統(tǒng)法提取組。傳統(tǒng)法獲得數(shù)據(jù)38.10%，5.06%，與倪受東［4］研究中多糖含量6.54%接近。超聲波法優(yōu)于紀(jì)耀華等［5］研究的微波法提取大黃多糖的工藝，微波法大黃多糖的最佳工藝條件為提取時間3min，微波功率400W，料液比1∶10，pH值為10。

大黃多糖抗NDV活性試驗，根據(jù)新城疫病毒性疾病的發(fā)病特點，結(jié)合可能出現(xiàn)的用藥時機，排除了中藥與病毒自然環(huán)境下作用后再作用細(xì)胞的臨床發(fā)生可能，設(shè)定兩種給藥方式，一種先加大黃多糖作用12h，再加入病毒吸附作用，目的是觀察藥物能否進入細(xì)胞或吸附于細(xì)胞表面，以阻止病毒的吸附與侵入［6］，另一種先加病毒吸附作用后，再加入大黃多糖，目的是觀察藥物能否對已進入細(xì)胞內(nèi)的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟釋放［6］。通過MTT檢測細(xì)胞活性結(jié)合CPE的方法發(fā)現(xiàn)，大黃多糖在兩種作用方式下對DNV均有抑制作用，先加多糖組抗NDV活性略高于先加病毒組，治療指數(shù)均為4，高于抗病毒藥物研究效果評價中治療指數(shù)大于2的標(biāo)準(zhǔn)。這兩種加藥方式從不同側(cè)面探討了中藥的直接抗病毒機理，結(jié)果表明大黃多糖在這兩種抗病毒途徑中均發(fā)揮了較好的作用，關(guān)于大黃多糖抗NDV研究的仍無報道，但與任宇皓等［7］人對黃芪多糖，淫羊藿多糖抗NDV活性評價比較，大黃多糖抗NDV的治療指數(shù)4高于黃芪、淫羊藿多糖先加多糖組的3，說明大黃多糖體外抗NDV活性很高，具有研究價值。

［1］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999.

［2］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.3版.北京：北京科學(xué)出版社，1997.

［3］趙燕，劉莉，楊興斌，等.中藥大黃多糖中單糖組成的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析［J］.分析化學(xué)研究簡報，2006（34）：255-258.

［4］倪受東，嚴(yán)德江，徐先祥.大黃多糖的提取及含量測定［J］.中國藥業(yè)，2007，16（13）：10-13.

［5］紀(jì)耀華，紀(jì)躍芝，馬愛民，等.微波法提取大黃多糖最佳工藝優(yōu)化研究［J］.中藥材，2009，9：118-120.

［6］李凡，易世紅，趙春艷，等.雙黃連粉針劑抗病毒作用［J］.中草藥，2002，33（1）：52-54.

［7］任宇皓，胡元亮.黃芪多糖、淫羊霍多糖和淫羊藿總黃酮對NDV，IBDV活性的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000.