DNA甲基化轉移酶1在非小細胞肺癌中的

表達及臨床意義

劉啟明

(江蘇省睢寧縣人民醫院呼吸內科,江蘇徐州,221200)

近10年來,肺癌的發病率和死亡率一直位居各種惡性腫瘤首位。肺癌的發生也是多因素作用、多基因參與、經過多個階段才最終形成的極其復雜的生物學特征。DNA甲基轉移酶 1(DNMT1)是細胞生命所必需的蛋白,其催化的甲基化修飾在調控細胞正常生長中有重要作用。DNA的甲基化有其重要的生物學意義,它在控制基因的表達、維持染色體的完整性和調節DNA的重組等方面都有重要的作用[1]。DNMT1在肺癌組織中表達以及與腫瘤的分期、分化程度、年齡、性別、吸煙等臨床特征的關系,目前國內外研究的較少。本實驗采用免疫組織化學技術檢測非小細胞肺癌組織中和DNMT1蛋白表達情況,并探討表達與患者臨床特征的關系。為探討DNMT1在非小細胞肺癌(NSCLC)中的發病機制、病理診斷、預后價值以及為選擇治療的靶點提供一定的理論和實驗依據。現報告如下。

圖1 病理分型

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院胸外科2005年3月～2008年10月手術切除的NSCLC(術前均未行化療和放療)標本54例。其中男33例、女21例,<60歲者28例;≥60歲者26例;有長期吸煙史22例,無吸煙史32例;鱗癌 25例,腺癌 29例,見圖 1;高分化11例,中分化 31例,低分化12例;Ⅰ期 22例,Ⅱ期10例,Ⅲ～Ⅳ期22例(根據術后病理,依據1997國際抗癌聯盟制定的肺癌TNM分期標準進行分期)。并分別取癌旁組織(在癌灶周邊5 cm內的肺組織)48例及周圍正常肺組織(遠離癌灶5 cm以上,且鏡檢無癌細胞)24例。所有組織標本使用中性甲醛固定,石蠟包埋備用。

1.2 方法

組織學染色:肺組織病理標本使用中性甲醛固定,石蠟包埋,5 μ m連續切片,常規 HE染色。測定程序性細胞死亡4(PDCD4)和DNMT1的免疫組織化學染色:①石蠟切片置于60℃烤箱中烤片2 h,常規脫蠟入水;蒸餾水沖洗1次;②0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0即配即用)微波爐抗原修復,加熱至沸騰,自然冷卻;③0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min×3次;④3%過氧化氫室溫孵育10 min,以阻斷內源性過氧化物酶;⑤0.01M PBS沖洗3 min×3次;⑥滴加兔抗人PDCD4、DNMT1及PBS空白對照,于4℃過夜;⑦DAB顯色試劑盒顯色,室溫2 min,顯微鏡下控制反應時間,蒸餾水沖洗終止反應;⑧蘇木素輕度復染細胞核;⑨中性樹封片,顯微鏡下觀察免疫反應陽性結構的著色、分布情況。

1.3 實驗結果判定

每例標本均用PBS代替一抗作陰性對照,以已知陽性片作為陽性對照。細胞質內出現淡黃色至棕褐色顆粒為陽性染色。參考Monica等的半定量計數方法,根據腫瘤組織細胞的染色率和染色強度進行判定。在400倍鏡下選取5個視野,計數至少500個腫瘤細胞中DNMT1蛋白陽性表達細胞所占百分率。腫瘤細胞陽性率<5%為0分,5%≤腫瘤細胞陽性率<25%為1分,25%≤腫瘤細胞陽性率<50%為2分,50%≤腫瘤細胞陽性率<75%為3分,≥75%為4分;根據染色強度分為 3類,弱為 1分,中等為 2分,強為3分。每個視野陽性細胞率與染色強度得分相乘為每個視野得分,最終得分為5個視野的平均值。規定0～4分為陰性,5～8分為陽性表達,9～12分為高表達。

2 結果

2.1 DNMT1的表達

DNMT1在 NSCLC組織、癌旁組織、正常肺組織中表達陽性率分別為39/54(72.2%)、30/48(62.5%)、0/24(0%),癌及癌旁組織與正常組織表達之間的均有統計學意義(P<0.01)。癌及癌旁出現高表達(見表1,圖2)。

表1 DNMT 1在肺癌組織、癌旁及正常組織中的表達(例)

2.2 DNMT1在肺癌組織中表達與TNM分期的關系

TNMⅠ期DNMT1在肺癌組織中表達陽性率為72.7%(16/22),DNMT1在Ⅱ期肺癌中陽性率為80.0%(8/10),DNMT1在Ⅲ～Ⅳ期肺癌中陽性率為68.2%(15/22)。各組之間差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 DNMT1在肺癌組織中表達與TNM分期、NSCLC組織分化程度、患者臨床病理特征的關系(例)

圖2 不同組織DNMT1的表達

2.3 DNMT1的表達與肺癌組織分化程度關系

DNMT1的表達與肺癌組織分化程度無關,差異無統計學意義(P<0.05),見表2。

2.4 DNMT1表達與患者臨床病理特征的關系

DNMT1的表達與 NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型等臨床特征差別均無統計學意義(P>0.05),見表2。

3 討 論

DNA的甲基化是由DNA甲基化轉移酶家族DNMTs(DNA C5胞嘧啶甲基轉移酶)介導,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基化供體,將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶(5mC)的一種反應。DNA的甲基化有其重要的生物學意義,它在控制基因的表達,維持染色體的完整性和調節DNA的重組等方面都有重要的作用。許多研究表明,很多腫瘤的發生都與相關抑癌基因啟動子區域CpG島的甲基化有關[2-3]。這種基因與細胞周期、DNA的修復、分化、凋亡、腫瘤轉移和血管的形成等密切相關。

Bestor等[4]于1988年克隆了第一個真核生物C5胞嘧啶甲基化轉移酶1-DNMT1,該基因編碼含1620個氨基酸殘基的蛋白質,分子量為190 kD。DNMT1主要作用是在每次DNA復制后的修飾過程中,對新合成的DNA鏈進行甲基化。

多種癌組織中一些腫瘤的相關基因如p73、p16 、E-cadherin 、SOCS-1 、RUNX-3 、cyclinD2 、CDH1、RAR-β等存在啟動子區域CpG島的甲基化,這些基因具有負調控細胞周期、錯配修復、血管生成抑制、細胞黏附等功能,此種修飾可使該基因在癌組織中沉默,致使腫瘤的發生。

國內顧立萍等[5]利用免疫組化SP法研究了DNMT1在胃癌中的表達情況,結果表明與正常的胃粘膜組織相比,在胃癌組織中,DNA甲基化修飾率有可能顯著提高。吳振啟等[6]檢測結果發現膀胱癌組織中DNMT1陽性表達率明顯高于正常組織,說明DNMT1高表達可能與膀胱癌的發生發展有關。翟榮林等[7]發現結腸表觀遺傳調節是通過甲基化活性增強而不是去甲基化活性減弱實現的。用RT-PCR法研究DNMTs在正常血細胞和急慢性髓細胞性白血病中mRNA的表達時發現,DNMT1急性髓細胞性白血病和慢性髓細胞性白血病的急性期mRNA的表達比正常骨髓細胞分別增高5.3和2.3倍。Park HJ[8]用RT-PCR法測得DNMT1 mRNA在肝癌和正常肝組織中的表達分別為33.3%和40.7%,同時抑癌基因也存在著甲基化現象。楊希等[9]采用免疫組化法檢測95例肺腺癌和癌旁正常組織中的DNMT1的蛋白表達情況,結果48例患者癌組織呈陽性表達,而癌旁正常組織全部呈陰性表達。亞組分析顯示DNMT1的蛋白陽性表達與性別顯著相關(P=0.018),女性肺腺癌表達明顯增高,表明DNMT1表達增高可能與體內的雌激素水平有關。通過 Kaplan-meier法和 Log-Rank法分析顯示,DNMT1的蛋白陽性表達是肺腺癌患者預后差的標志。Kwon YM[10]研究顯示吸煙>65包/年的肺癌患者DNMT1 mRNA表達是吸煙<45包/年肺癌患者的 4.17倍。提示DNMT1陽性表達增高與吸煙的量有關。以上資料證明DNMT1在許多實體瘤和造血系統的腫瘤中表達均明顯升高。

本組實驗結果發現 DNMT1在 NSCLC組織、癌旁、周邊正常組織中表達陽性率分別為39/54(72.2%)、30/48(62.5%)、0/24(0%), 癌、癌旁組織與正常組織表達之間的差異有統計學意義(P<0.01)。表明DNMT1在肺癌組織中呈現高表達,在正常肺組織中表達為陰性,與楊希等[9]研究結果一致。提示DNMT1可以作為非小細胞肺癌病理診斷的標志物。本組資料顯示DNMT1在肺癌組織中的表達與TNM分期、細胞分化程度、患者年齡、吸煙史均無相關性。在吸煙和不吸煙的癌組織中表達相近,與楊希等[9]研究資料相同。而與Kwon YM[10]研究在吸煙>65包/年和<45包/年肺癌患者中表達存在著差異不同。在Ⅰ期和Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期之間差異均無統計學意義(P>0.05)。提示DNMT1與NSCLC的預后相關性較差。女性、腺癌DNMT1的表達略高于男性、鱗癌,但統計學無差異(P>0.05),與楊希等[9]研究在女性腺癌中表達較高,相對男性對照組有統計學差異不同。是否與樣本量過少有關,有待進一步研究。

本研究發現:①DNMT1在NSCLC癌組織、癌旁組織中出現高表達,在正常肺組織中表達缺失,提示DNMT1參與NSCLC發病機制,可以作為病理診斷NSCLC的標志物。②DNMT1與非小細胞肺癌的分化程度、TNM分期、患者的發病年齡、性別、吸煙史、組織學類型均無顯著性差異。不能作為臨床預后指標。

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