百癬夏塔熱膠囊對小鼠接觸性皮炎的作用及機制研究

陳菲菲,朱曉芳,高 慧,駱 丹

(1.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科,江蘇揚州,225001;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,江蘇南京,210029)

變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)是皮膚、黏膜接觸致敏物后,由T細胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起的炎癥性皮膚病。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子在變應(yīng)性接觸性皮炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,核因子-κ B參與免疫與炎癥的調(diào)節(jié)過程。百癬夏塔熱膠囊具有清除異常黏液質(zhì)、膽液質(zhì)及敗血、消腫止癢,清熱解毒等功能,用于治療過敏性皮炎、帶狀皰疹、花斑癬、銀屑病、和痤瘡等。本研究通過建立小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型,觀察百癬夏塔熱膠囊對小鼠ACD的治療作用,探討百癬夏塔熱膠囊對小鼠ACD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

實驗用小鼠為揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供的昆明小鼠42只,雌雄各半,6～8周齡,體重25～30 g。小鼠飼養(yǎng)于金屬籠中,隨意飲食、飲水,周圍溫度20℃,濕度60%。

1.2 主要試劑和試劑盒

2,4-二硝基氟苯(SigmaAldrich公司)、百癬夏塔熱膠囊(陜西東泰制藥)、地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司)、TNF-α ELISA試劑盒、NF-κ B免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 實驗器材與儀器

皮膚圓形打孔器(直徑6 mm)、電子分析天平、數(shù)顯游標卡尺、微孔板酶標儀、酶標儀洗板機。

1.4 實驗方法

小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型建立:①DNFB配備:250 mg DNFB加入4:1體積比的丙酮與橄欖油混合液50 mL,配成0.5%的DNFB溶液;將250 mg DNFB加入4:1體積比的丙酮與橄欖油混合液125 mL,配成0.2%的DNFB溶液。②取昆明小鼠10只,雌雄各半,小鼠于實驗前1天在腹部備皮2 cm×1.5 cm,用8%硫化鈉水溶液脫毛,生理鹽水充分擦洗。實驗第1天、第2天在腹部去毛部位涂布0.5%的25 μ L DNFB溶液致敏。實驗第6天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20 μ L DNFB溶液誘發(fā)皮炎。右耳涂布20 μ L基質(zhì)[1]。建立小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型。實驗第7天觀察小鼠左耳大體形態(tài)變化,處死后取左耳皮損行組織病理檢查,判定造模是否成功。

百癬夏塔熱膠囊對小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的影響:①實驗分組:造模成功后,32只小鼠被隨機分為4組,分別為正常對照組、模型組、地塞米松對照組和百癬夏塔熱給藥組,每組8只。②DNFB誘發(fā)模型:同小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型建立。③給藥方法:百癬夏塔熱組小鼠體重用藥量為30 g左右小鼠0.1片/d(藥物劑量按每千克體質(zhì)量為《中華人民共和國藥典》規(guī)定臨床用量的20倍),溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中,將藥物濃度校正到實驗中每30g小鼠體質(zhì)量灌胃量為0.4 mL。地塞米松體重用藥量為30 g左右小鼠0.09 mg/d(按成人每天地塞米松9 mg,小鼠用藥量為20倍),溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中,每次取0.4 mL灌胃。模型組每次予以生理鹽水0.4 mL灌胃。實驗第1天起各組自第1次涂藥前2 h灌胃,連續(xù)用藥5 d,1次/d。實驗第6天涂藥前2 h及涂藥后6 h灌胃各1次。所有小鼠于第7天摘眼球取血備用。測量小鼠雙耳中部厚度,用皮膚圓形打孔器沿小鼠左耳耳緣中部打孔,所取左耳組織置于95%酒精中固定。進行組織病理檢查及免疫病理檢查。

觀察指標:①耳厚度差:數(shù)顯游標卡尺測量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度,計算誘發(fā)后左右耳厚度差。②組織病理檢查:處死后取小鼠左耳組織常規(guī)石蠟切片,HE染色。光鏡觀察組織病理變化。③NF-κ B在皮損處的表達:小鼠左耳組織進行常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,熱修復(fù)抗原,滴加5%BSA封閉液,然后依次加入一抗、生物素化二抗,SABC后,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。④血清TNF-α檢測小鼠摘除眼球取血1.5 mL,靜置15 min后,3 000 r/min離心15 min,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中細胞因子TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的建立

用DNFB誘發(fā)的小鼠左耳腫脹、充血,耳部血管擴張。組織病理顯示表皮角化過度,表皮增厚,表皮細胞間及細胞內(nèi)水腫,能發(fā)現(xiàn)較多的單一核細胞及少數(shù)多形核細胞的浸潤。真皮結(jié)締組織水腫,血管周圍可見輕度細胞浸潤(見圖1)。小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型成功建立。

2.2 各藥物對鼠耳厚度的影響

肉眼觀察,模型組小鼠左耳腫脹、充血,可見耳部血管擴張。地塞米松對照組及百癬夏塔熱給藥組小鼠左耳腫脹不明顯,無明顯充血。地塞米松組及百癬夏塔熱組誘發(fā)后小鼠左右耳厚度差與模型組相比明顯減小。地塞米松及百癬夏塔熱膠囊能有效改善變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠耳腫脹情況,見表 1。

圖1 小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎臨床、組織病理改變(HE染色 100倍)

表1 百癬夏塔熱膠囊對接觸性皮炎小鼠耳厚度差的影響( x±s)

圖2 各藥物對組織病理的影響(HE染色 100倍)

2.3 各藥物對組織病理學(xué)的影響

模型組HE染色切片可見:表皮角化過度,表皮增厚,表皮細胞間及細胞內(nèi)水腫,能發(fā)現(xiàn)較多的單一核細胞及少數(shù)多形核細胞的浸潤。真皮結(jié)締組織水腫,血管周圍可見輕度細胞浸潤。地塞米松對照組及百癬夏塔熱給藥組HE染色切片可見:表皮、真皮無明顯水腫,炎性細胞浸潤減少(見圖2)。

2.4 各藥物對NF-κ B檢測結(jié)果的影響

NF-κ B p65在變應(yīng)性接觸性皮炎皮損角質(zhì)形成細胞核周和胞漿表達,模型組皮損處胞漿及部分胞核可見棕黃色顆粒沉著。百癬夏塔熱組及地塞米松組NF-κ B p65表達明顯減少甚至消失,正常對照組未見NF-κ B p65表達(見圖 3)。

圖3 各藥物對耳組織NF-κ B表達的影響(SP染色 200倍)

2.5 各藥物對小鼠血清中細胞因子TNF-α的影響

模型組小鼠血清中TNF-α水平比正常對照組明顯升高,經(jīng)百癬夏塔熱膠囊及地塞米松處理后的小鼠血清TNF-α水平與模型組相比明顯下降,百癬夏塔熱膠囊及地塞米松能降低變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠血清中TNF-α含量,抑制了變應(yīng)性接觸性皮炎的炎癥反應(yīng),見表2。

表2 各組小鼠血清中TNF-α數(shù)值測定( x±s)

實驗前各組小鼠體重?zé)o明顯差異,各組給藥過程中體重略有下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明百癬夏塔熱膠囊對小鼠生理及代謝功能無明顯影響,各組動物一般狀況良好。

3 討 論

變應(yīng)性接觸性皮炎屬于與Ⅳ型變態(tài)反應(yīng),皮疹多形性、劇烈瘙癢、易于復(fù)發(fā)。目前大多數(shù)觀點認為,變應(yīng)性接觸性皮炎主要由 Th1型細胞介導(dǎo),而Th2型細胞參與其調(diào)節(jié)過程。

TNF-α主要由Th1細胞分泌,它在ACD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2],TNF-α是重要的炎癥前介質(zhì),可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中多種細胞因子的產(chǎn)生、黏附分子(如ICAM-1)和協(xié)同刺激因子的表達[3-4],也具有局部促炎性反應(yīng)作用,改變血管內(nèi)皮細胞的通透性,增加血管滲出,刺激中性粒細胞等炎性細胞的趨化反應(yīng),從而啟動炎性反應(yīng),加強單核巨噬細胞的吞噬功能,誘導(dǎo)前列腺素的合成等。同時促進成纖維細胞生長,刺激IL-1、IL-6、單核細胞趨化蛋白(MCP)等其他細胞因子合成釋放,產(chǎn)生細胞因子的瀑布效應(yīng)。在變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)病過程中能夠最終導(dǎo)致白細胞、淋巴細胞及單核細胞等外滲至組織內(nèi)引起炎癥反應(yīng)。同時,腫瘤壞死因子TNF-α對朗格漢斯細胞的活化、移動和抗原的提呈起重要作用[5]。

NF-κ B在變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)病過程中起著重要的作用,首先NF-κ B在抗原遞呈細胞成熟階段與分化中起重要的作用,它是樹突狀細胞成熟過程中炎癥刺激信號的轉(zhuǎn)換器,與樹突狀細胞的成熟密切相關(guān)[6],促進了變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)病初始階段抗原遞呈作用。其次NF-κ B可能作為始發(fā)炎癥反應(yīng)的上游環(huán)節(jié)在疾病中起重要作用。活化的NF-κ B參與機體多種蛋白、酶及細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[7],激活的NF-κ B可誘導(dǎo)免疫細胞的多種炎癥相關(guān)基因表達[8]、炎細胞因子(TNF-α、IL-1 、IL-6)、趨化因子、協(xié)同刺激分子及黏附分子等表達,進而參與免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控。因此NF-κ B的激活就可作為炎性反應(yīng)的觸發(fā)器及關(guān)鍵環(huán)節(jié),瀑布式誘導(dǎo)機體一系列炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生[9],最終導(dǎo)致炎性病理損傷。

腫瘤壞死因子(TNF-α)是誘導(dǎo)NF-κ B活化的重要細胞因子。TNF-α能夠調(diào)節(jié)皮膚炎癥相關(guān)分子的表達而激發(fā)皮膚炎癥。已有多項研究結(jié)果支持NF-κ B與TNF-α之間可形成相互激活的級聯(lián)反應(yīng)。TNF-α正反饋調(diào)節(jié)NF-κ B激活后,可增強TNF-α和IL-1β等的基因轉(zhuǎn)錄,促使TNF-α和IL-1β產(chǎn)生和釋放增多,后者又導(dǎo)致NF-κ B的進一步激活。

百癬夏塔熱膠囊是由蘆薈、地錦草、司卡摩尼亞脂、毛訶子肉、訶子肉、西青果等藥加工而成的維藥制劑,能穩(wěn)定肥大細胞的細胞膜,抑制肥大細胞脫顆粒,提高致癢閥[10]。現(xiàn)代藥理研究證明,蘆薈和訶子具有抗炎、止癢、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理作用[11],訶子肉,毛訶子肉、西青果的主要有效成分均為沒食子酸[12]。沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化等多種生物學(xué)活性。

百癬夏塔熱膠囊臨床上可以用于過敏性皮炎等疾病的治療,但治療的機理少有人研究。本實驗結(jié)果表示,通過小鼠耳腫脹度及組織病理的變化,證明百癬夏塔熱膠囊對小鼠變應(yīng)性接觸性接觸性皮炎有明顯的治療作用。百癬夏塔熱膠囊明顯抑制小鼠DNFB誘發(fā)的ACD,表明該藥具有抑制T淋巴細胞參與的過敏反應(yīng),同時對DNFB引起的炎癥反應(yīng)有抑制作用。百癬夏塔熱膠囊對小鼠接觸性皮炎的免疫調(diào)節(jié)作用除了直接抑制Th1細胞相關(guān)的細胞因子 TNF-α表達外,還可能通過直接或間接抑制NF-κ B的活化,從而進一步抑制NF-κ B調(diào)控的促炎細胞因子。從而對ACD起到治療作用。目前,治療變應(yīng)性接觸性皮炎的主要藥物是抗組胺藥及激素,百癬夏塔熱膠囊可以作為治療的有益的補充。

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