免疫反應及他汀類藥物在大鼠心肌肥厚中的作用

譚 曉,衛 慧,王迪斌,朱 嶸,郭曉敏,李秀珍,高 瑩

(南京醫科大學第二附屬醫院心內科,江蘇南京,210011)

心肌肥厚是由于心肌細胞外信號刺激,引起一系列受體介導的細胞信號轉導,以及核內某些基因活化而出現的,是心肌細胞肥大、心肌間質細胞增殖以及心肌細胞外基質改建等心肌重塑的結果,為心力衰竭、心律失常及猝死的重要原因之一。近年來相關研究表明,心肌肥厚可能與機械性因素、神經體液因素、細胞因子及遺傳等相關。但是,心肌肥厚常伴隨白介素-6(IL-6)、IL-1β、心肌肥厚因子-1(CT-1)、IL-18及 C反應蛋白等炎性因子的異常表達。臨床治療心肌肥厚常采用血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑、鈣離子拮抗劑、β受體阻滯劑、利尿劑、抗心律失常藥等藥物以及起搏器、手術和介入治療等,但療效有限,且手術及介入治療風險高。而他汀類藥物因其顯著的降脂作用可防治心腦血管疾病,其他諸多非降脂效應,如抗炎、抗氧化、改善內皮細胞功能、抑制平滑肌細胞增殖等,可有效抑制心肌肥厚的發生[1-3]。本研究擬從免疫機制出發,旨在探討其在心肌肥厚中的作用,以及他汀類藥物對心肌肥厚的影響。

1 資料與方法

1.1 主要材料和試劑

阿托伐他汀(商品名:立普妥,美國輝瑞公司生產),一抗(CD4 antibody、CD8 antibody、TNF-α antibody)購自美國Abcam 公司,二抗(羊抗兔,貨號:111-035-003;兔抗羊,貨號:305-035-003)購自JACKSON公司,SP試劑盒購自福州邁新生物科技有限公司,蘇木素染色液購自福州邁新公司,切片機購自美國Reichert Histostate公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組:SD大鼠共36只(南京醫科大學實驗動物中心提供),體質量220～300 g,雌雄不限,用標準顆粒性飼料喂養1周后(洗脫期)隨機分成5組,包括:①正常對照組6只;②心肌肥厚組6只;③脾細胞輸注組6只;④心肌肥厚+他汀組6只;⑤脾細胞輸注+他汀組6只;另外6只為待取脾細胞的心肌肥厚大鼠。

1.2.2 心肌肥厚大鼠模型的制備[4]及給藥方法:按上述分組,將心肌肥厚組和心肌肥厚+他汀組的大鼠制作心肌肥厚模型。將SD大鼠給予鹽酸氯胺酮注射液(2 mL∶0.1 g)2 mL/kg麻醉后,仰臥固定于鼠臺上,用3%碘酒和75%乙醇消毒后從腹部正中劍突下切開皮膚2 cm左右,打開腹腔,在腎動脈上方分離一小段腹主動脈,穿過一條絲線,將去尖的7號針頭連同腹主動脈一并結扎,然后立即抽出針頭,即造成腹主動脈的縮窄,再將內臟恢復原位,關閉腹腔,繼續飼喂。予④、⑤2組阿托伐他汀按2 mg/(kg·d)劑量灌胃,持續8周。其余組用等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 脾細胞的分離和輸注:取飼養4周的待取脾細胞的心肌肥厚大鼠6只,處死后取其脾臟,在2℃的生理鹽水中浸泡10 min,經100目不銹鋼絲網在2%BSA-HanKs液中研磨,制成勻漿,收集濾液后,經水平離心機2 000 r/min×15 min離心,棄上清;低滲法破除紅細胞。10%BSAHanKs液洗滌脾細胞2次。RPMI 1 640懸浮細胞用2%臺盼藍染色,顯微鏡下觀察細胞活力>95%。RPMI 1 640重懸細胞,調整濃度至100×106～150×109個/L。將脾細胞懸液1 mL經尾靜脈輸注予③、⑤組。

1.2.4 左室質量和體質量的測定:動物稱質量后處死,取出心臟,分離左右心室,用電子天平稱取左心室質量(LVM),計算左心室重量指數(LVI)=左心室質量與體質量比(LVM/BW)表示左心室肥厚的程度。

1.2.5 心臟超聲檢查:大鼠以7.5%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后備皮,應用超聲心動圖(VIVID7型號,美國GE公司)及7.5MHz高頻線控探頭(美國GE公司),進行超聲檢測,取胸胃旁左室長軸切面,M型超聲心動圖取樣線取心底波群,測主動脈根部內徑和左房的大小。高頻線控探頭置于心尖部,取心尖四腔圖,取樣容積置于二尖瓣瓣口,獲得舒張期二尖瓣血流頻譜,上述均按照美國超聲醫學標準進行。連續儲存獲得上述的超聲圖像,然后再用實時、慢速回放及凍結圖像等技術對圖像進行分析處理。各測量數據均取5個心動周期的均值。測量的指標:左室射血分數(EF)=(EDV-ESV)/EDV,左室短軸縮短率(FS)=(LVDd-LVDs)/LVDd,室間隔厚度(IVS),左室后壁厚度(LVPW),舒張末期左室內徑(LVD)和收縮末期左室內徑(LVS)。

1.2.6 心肌CD4、CD8、TNF-α蛋白的表達的測定:采用免疫組化方法。取各組大鼠左室游離壁及心尖部心肌,制成石臘切片,將切片放入60℃恒溫箱中烘烤60 min,脫臘,再分別在無水乙醇中浸泡5 min,95%乙醇中浸泡5 min,85%乙醇中浸泡5 min,70%乙醇中浸泡5 min,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,進行抗原修復,再次洗滌后,用3%H2O2滅活內源性過氧化物酶,PBS液洗滌5 min,共3次,加入一抗100 μ L,繼續PBS洗滌5 min,共3次,加入增強劑,37℃孵育20 min,洗滌后,加酶標二抗,洗滌后 DAB顯色,終止顯色后復染,封片。以PBS代替一抗作陰性對照,應用 imagepro-plus軟件系統對 CD4、CD8、TNF-α表達進行圖像分析,每張切片放大400倍,隨機選取3個視野,以心肌細胞間隙、血管周圍和細胞表面呈棕褐色顆粒為陽性,以平均光密度作為圖像的輸出結果,測定各組心肌標本的CD4、CD8、TNF-α。

圖1 心肌肥厚組與正常對照組心肌大體標本

2 結 果

2.1 模型制備

4周后取正常對照組與心肌肥厚組大體標本觀察可見,肥厚組心肌較對照組心肌明顯肥厚,見圖1。

2.2 各組大鼠LVI

心肌肥厚組LVI(2.77±0.12)較正常對照組(2.11±0.14)升高31.2%(P<0.05);脾細胞輸注組(2.58±0.16)較正常對照組升高22.3%(P<0.05);心肌肥厚+他汀組(2.33±0.14)較肥厚組下降15.7%(P<0.05);脾細胞輸注+他汀組(2.25±0.10)較脾細胞輸注組下降12.8%(P<0.05)。

2.3 各組大鼠的心臟超聲結果

8周后,測定大鼠心臟超聲結果。除肥厚+他汀組及脾細胞輸注+他汀組中的LVD,脾細胞輸+他汀組的 LVPW、LVS外,其他各組大鼠IVS、LVPW、LVD、LVS與正常對照組相比明顯增大,而 EF、FS明顯降低(P<0.05或P<0.01);心肌肥厚組大鼠的IVS、LVPW、LVS較脾細胞輸注組顯著增大,EF和FS顯著降低(P<0.01);心肌肥厚組加上他汀藥干預后,上述指標較心肌肥厚組有明顯改善(P<0.01),脾細胞輸注組加上他汀藥干預后,LVPW、LVS、EF、FS較單純脾細胞輸注組明顯改善(P<0.05或P<0.01)。見表 1。

表1 5組超聲心動圖形態學及功能學指標的比較

2.4 心肌 CD4、CD8、TNF-α蛋白的表達

與正常對照組相比,其他各組大鼠CD4、TNF-α均明顯升高(P<0.05),而CD8表達明顯降低(P<0.05);心肌肥厚組CD4、TNF-α的表達較其他各組升高幅度最為明顯,CD8降低幅度較其他各組也最為明顯;心肌肥厚+他汀組CD4、TNF-α表達較肥厚組已有明顯回落,但仍較脾細胞輸注組為高,而CD8則有一定幅度上升,但仍低于脾細胞輸注組;脾細胞輸注+他汀組CD4、TNF-α表達較脾細胞輸注組有降低,但仍高于正常對照組,CD8較脾細胞輸注組升高,較正常對照組為低。CD4/CD8在肥厚組最大,其次是心肌肥厚+他汀組、脾細胞輸注組、脾細胞輸注+他汀組、正常對照組。見圖2～5。

圖2 CD4、CD8和TNF-左室心肌的表達

3 討 論

圖3 免疫組化檢測CD4在心肌中的表達 (DAB顯色 400倍)

圖4 免疫組化檢測CD8在心肌中的表達 (DAB顯色 400倍)

圖5 免疫組化檢測TNF-α在心肌中的表達 (DAB顯色 400倍)

心肌肥厚是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應性反應,目前認為心肌肥厚的形成與細胞外多種因素刺激細胞內的信號轉導和核內的某些基因活化有關[5],常見的臨床病因是心臟的壓力負荷增高。壓力超負荷一方面直接刺激細胞生長,另一方面可刺激心肌組織結構變異,使心肌組織產生自身抗原,誘發免疫反應及產生各種內分泌因子,如RAS、兒茶酚胺類、胰島素樣生長因子、IL-6等,進一步活化免疫細胞?；罨腂和T細胞能識別細胞核內的自身抗原決定簇,通過信號轉導,誘導產生CT-1、AT-II、醛固酮等[6],促進心肌重構。同時B、T細胞還能識別心肌肌球蛋白上多個抗原決定簇,刺激其發生增殖。自身免疫反應過去被認為是病毒性心肌炎和擴張性心肌病的主要機制[7],而其在心肌肥厚中的作用還知之甚少,值得進一步深入探究。CD4為輔助性T細胞標志,T淋巴細胞活化時,通過T細胞表面受體(TCR)識別與主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類分子相連的抗原肽,從而形成TCR-抗原肽-MHC二類分子復合物。識別后CD4分子結合于MHCⅡ類分子的非多態部位,增加T細胞內信號轉導,共同構成了細胞活化的第一信號,輔助B細胞產生抗體,放大免疫應答。而CD8是T抑制/殺傷細胞(TS/TC)的表面標志,具有抑制T細胞活化,阻止B細胞產生抗體,從而抑制細胞及體液免疫效應,發揮其免疫調節作用。

本實驗通過縮窄腹主動脈制造心肌肥厚模型,模擬壓力超負荷導致的心肌肥厚,造模后大鼠心肌明顯增厚,心室重量指數升高,提示壓力超負荷是心肌肥厚的主要因素之一;本實驗將心肌肥厚大鼠的脾細胞輸注給正常SD大鼠,發現受者CD4、TNF-α的表達較對照組明顯升高,CD8降低,說明心肌肥厚大鼠的脾細胞進行過繼傳輸,受者大鼠體內的心肌也發生一定程度的肥厚,與文獻報道一致[8-9]。他汀類藥物是羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑,常規認為其通過阻斷該酶使膽固醇合成減少,增加膽固醇的清除,達到調脂的作用。但他汀類藥物除了調脂,還具有一定的調節免疫[10]、抗炎、抗氧化、降低 C反應蛋白[11]等多重效應。張雪娟等[12]認為:阿托伐他汀可明顯降低CT-1、IL-18水平,對壓力負荷導致的心肌肥厚有明顯的保護作用,可能與其抗炎作用有關。本實驗結果顯示阿托伐他汀能明顯降低肥厚組及脾細胞輸注組CD4,TNF-α蛋白表達,而CD8蛋白表達上升,具有顯著抗心肌肥厚作用,其抗心肌肥厚作用機制可能與其阻斷細胞免疫信號轉導,抑制炎性因子分泌,降低免疫應答從而調節免疫炎癥作用相關。但免疫調控是一個復雜的網絡體系,該實驗觀察指標有限,阿托伐他汀調節免疫機制還有待更多的研究來證實。

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