2-型豬鏈球菌保護性抗原RfeA的B細胞表位預測

劉麗娜,潘渠,朱軍民,叢延廣,劉紅美,李程

(1.貴陽醫學院基礎醫學院醫學生物技術教研室,貴州 貴陽 550004;2.第三軍醫大學基礎醫學院微生物學教研室,重慶 400038;3.重慶市永榮礦務局總醫院病理科,重慶 402460)

豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)能引起豬腦膜炎、心內膜炎、敗血癥、多關節炎、多漿膜炎、肺炎和突然死亡,是造成世界養豬業重大經濟損失的主要病原之一。目前已知的35個血清型中,血清2型的致病力最強、流行范圍最廣,可感染人。1998年和2005年大規模爆發人感染2-型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的嚴重公共衛生事件[1],迫使我們必須加強對SS2感染的預防和控制。實踐證明疫苗預防是消滅和控制傳染病的有效手段之一[2],但是迄今仍無有效預防SS2感染的疫苗。

表位疫苗(Epitope vaccine)是用抗原表位制備的疫苗,包括合成肽疫苗、重組表位疫苗和表位核酸疫苗,是目前有關傳染性疾病和惡性腫瘤疫苗的研制方向[3]。通常僅由一種抗原肽制備的疫苗,誘導的免疫保護作用較弱,含有多種B細胞或T細胞表位的多表位疫苗,可誘導更好的保護力。發展多表位疫苗有利于提供更完全更有針對性的免疫保護。另外,對抗原表位的研究,將深層次地揭示蛋白抗原誘導免疫應答的分子機制。

筆者在前期研究工作中,證實了RTX家族胞外蛋白A(RTX family exoprotein A,RfeA)能提供小鼠抵抗SS2高致病力菌株致死性攻擊的保護力,是SS2新的保護性抗原[4],對RfeA的進一步研究將有助于SS2疫苗的研制。本研究通過生物信息學方法對RfeA的B細胞表位進行分析和預測,為開展SS2多表位疫苗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 SS2保護性抗原RfeA的氨基酸序列

SS2全基因組序列測定和推定氨基酸序列參見文獻[5],RfeA含有186個氨基酸殘基。

1.2 SS2保護性抗原RfeA的二級結構柔性區域預測

用Garnier-Robson法[6]、Chou-Fasman法[7]和Karplus-Schulz法[8]預測RfeA二級結構中的柔性區域。

1.3 SS2保護性抗原RfeA的B細胞表位預測

用Kyte-Doolittle法[9]分析 RfeA的親水性,用Emini法[10]預測 RfeA的表面可能性,用 Jameson-Wolf法[11]預測RfeA的抗原性指數,綜合分析上述各方法的預測結果,最終推測RfeA的B細胞抗原表位。

2 結果

2.1 RfeA蛋白預測的二級結構柔性區域

按Garnier-Robson法預測的結果見圖1,按Chou-Fasman法預測的結果見圖2,按Karplus-Schulz法預測的結果見圖3,同時被3種方法預測為柔性結構的區域很可能就是RfeA蛋白的二級結構柔性區域。綜合分析圖1、圖2和圖3,RfeA蛋白的二級結構柔性區域位于 N-端的第 6～8、32～35、54-58、67～ 69、74～ 76、112～ 115、152～ 155。

圖6 RfeA蛋白的抗原性指數Fig.6 Antigenicity index for RfeA

2.2 RfeA蛋白的B細胞表位預測結果

采用 Kyte-Doolittle法、Emini法和 Jameson-Wolf法分別預測RfeA蛋白的親水性、表面可能性和抗原性指數,結果見圖4-6。經抗原性指數、蛋白質表面可能性指數和親水性指數篩選出的氨基酸區段中(抗原性指數≥0,表面可能性指數≥1,親水性指數≥0),如果其內部或附近又具有柔性結構,則很有可能為B細胞表位。綜合分析上述預測結果,RfeA 蛋白 N-端第 21～ 27、53-60、104～ 117、140～ 160 區段很有可能存在B細胞表位。

3 討論

表位的鑒定是構建表位疫苗的第一步。目前有多種方法用于抗原表位的實驗檢測和理論預測,如根據蛋白質一級結構預測法、化學“切割”法或酶法、肽探針掃描技術(交疊合成多肽的方法)、噬菌體展示技術、Ag-Fab復合物的X射線衍射和核磁共振(NM R)分析等[12]。根據蛋白質一級結構預測法具有簡單、直觀、快速等優點,被廣泛應用于疫苗研究[13-15]。因此,本研究采用蛋白質一級結構預測法來預測蛋白質的B細胞表位。

有效的保護免疫取決于一組表位的合理組合與搭配。抗原表位、連接方法、表達系統以及表位的加工效率都會影響到多表位疫苗的免疫效力,而且在設計表位疫苗時,還應根據機體對疾病的免疫應答特點及免疫保護機制,合理選擇特異性B細胞表位、Th表位或CTL表位來定向誘導宿主的B細胞應答、Th應答或CTL應答,或者采用多種類型的表位組合,同時誘發體液免疫和細胞免疫[12]。在前期的研究工作中,我們證實了RfeA能刺激小鼠機體產生較強的免疫應答,以體液免疫為主,能有效保護小鼠免受SS2高致病力菌株的致死性攻擊[4]。因此,在設計以RfeA為基礎的多表位疫苗時,選擇特異性B細胞表位,定向誘導宿主的B細胞應答。

通常蛋白質的二級結構與蛋白質的表位分布有較大關系。轉角和無規則卷曲區域的結構比較松散,易于發生扭曲、盤旋,并展示在蛋白分子表面,成為抗原表位的可能性較大。此外,蛋白質分子的親水性、表面可能性、柔韌性和抗原性等也與其抗原表位構成有密切的聯系。因此,本研究將蛋白親水性、表面可能性以及抗原指數的預測結果與二級結構中柔性區域的分析相結合,綜合判定含有B細胞表位的區段。通常使用單一方法和參數進行抗原表位的預測正確率不高,一般將多種方法和多參數分析的結果進行綜合,這樣可提高預測的準確性和可信性。

本研究通過生物信息學方法預測了RfeA的B細胞表位,為設計SS2的多表位疫苗和實驗驗證疫苗免疫效力奠定了基礎。

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