肝蘇對CCl4肝纖維化大鼠氧化應激和膠原表達的影響*

曲 穎宗 蕾沈 鐳王 燕徐銘益劉 梅竇愛霞陸倫根#

上海交通大學附屬第一人民醫院消化內科1（200080）

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科 上海市消化疾病研究所2

肝蘇是中藥扯根菜的成方制劑，具有清熱利濕、解毒活血、平肝健脾等作用，對黃疸性肝病、慢性病毒性肝炎等慢性肝病有一定治療作用[1,2]。本課題組的前期研究[3]發現肝蘇可促進人肝細胞增殖，保護肝細胞和肝星狀細胞（HSC）免受氧化應激損傷，且可抑制HSC分泌透明質酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、轉化生長因子-β1（TGF-β1），提示其具有肝細胞保護、抗氧化、抗肝纖維化作用。本研究以四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化模型，旨在觀察肝蘇對實驗性大鼠肝纖維化的防治作用并進一步探討其中的機制，為肝蘇臨床應用于抗肝纖維化提供理論和實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

健康雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠 63只，體質量約220 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養于上海交通大學醫學院實驗動物科學部。所有動物自由進食、飲水，溫度、濕度符合標準，明暗12 h/12 h循環。

肝蘇無糖型顆粒（四川古藺肝蘇藥業有限公司），3 g/袋，相當于16.7 g生藥，分別以蒸餾水配制成濃 度為 0.1 g/ml、0.2 g/ml、0.4 g/ml 的 溶液 。ALT試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司，AST試劑盒購自上海北加生化試劑有限公司，ALP試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司，血清HA檢測試劑盒購自Gentaur公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體購自Abcam公司，免疫組化二抗和DAB試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

ADVIA 1650全自動生化分析儀購自Bayer公司，Mat-3000酶標儀購自DRG公司，Ultraspec 2000型紫外/可見分光光度計購自Pharmacia Biotech公司。

二、動物分組和模型制備

所有大鼠適應性喂養1周，隨機分成5組，分別為正常對照組（7只）、肝纖維化模型組（14只）、低劑量肝蘇干預組（1 g/kg，14只）、中劑量肝蘇干預組（2 g/kg，14 只）、高劑量肝蘇干預組（4 g/kg，14只）。后四組大鼠先予皮下注射40%CCl4溶液（純橄欖油配制）0.5 ml/100 g，隨后予0.2 ml/100 g，2次/周×8周，建立大鼠肝纖維化模型[4]。正常對照組予相同劑量橄欖油皮下注射。肝蘇干預組于建模同時予相應劑量肝蘇溶液灌胃，正常對照組和肝纖維化模型組予相同劑量飲用水灌胃，1次/d×8周。

每周記錄大鼠體質量，觀察精神狀態、活動情況、皮毛光澤度等。

實驗過程中，低、中、高劑量肝蘇干預組分別有4、2、4只大鼠因灌胃溶液嗆入氣管而死亡。8周末，動物于麻醉狀態下抽取下腔靜脈血5 ml，貼壁注入試管，室溫靜置 3 h，2500×g離心 10 min，吸取上清液待檢。處死動物，稱量肝濕重后留取肝組織待檢。

三、血清學指標檢測

取 0.5 ml血清送檢驗科行 ALT、AST、ALP等血清肝生化指標檢測。另取200μl血清行HA檢測，酶標儀450 nm處讀取數據。

四、肝組織MDA和SOD檢測

按試劑盒說明書檢測肝組織MDA含量和SOD活性。

五、組織病理學檢查

取大鼠肝組織，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規HE和Masson染色，光學顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度[5]。

六、免疫組化染色檢測肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原

石蠟切片常規脫蠟、水化，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，行抗原修復，封閉。分別滴加α-SMA抗體（工作濃度1∶500）、Ⅰ型膠原抗體（工作濃度1∶400）、Ⅲ型膠原抗體（工作濃度 1∶500），4 ℃過夜。PBS沖洗，二抗孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判斷：以細胞質（α-SMA）或纖維（Ⅰ型、Ⅲ型膠原）呈棕黃色為陽性。隨機選取10個高倍視野（×400），Image-Pro Plus 6.0 軟件計算陽性染色面積占整個視野面積的百分比，取均值。

七、統計學分析

應用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以x±s 表示，檢驗方差齊性，多組間均數的比較采用單因素方差分析，肝纖維化分期半定量資料的比較采用多樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis檢驗），P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組大鼠基本情況比較

正常對照組大鼠生長狀況良好，肝纖維化模型組大鼠一般情況差，精神萎靡，皮毛光澤度欠佳，體質量增長速度明顯減慢，肝指數（肝濕重/體質量×100%）明顯升高。各劑量肝蘇干預組大鼠體質量增長較正常對照組稍緩慢，肝指數亦明顯升高，干預組與模型組間體質量增加值和肝指數差異無統計學意義（見表1）。

表1 各組大鼠基本情況和血清學指標比較（±s ）

表1 各組大鼠基本情況和血清學指標比較（±s ）

*與正常對照組比較，P＜0.05；#與肝纖維化模型組比較，P＜0.05

組 別 肝指數（%） ALT（U/L） AST（U/L） ALP（U/L） HA（ng/ml）正常對照組 3.72±0.21 54.71±6.78 103.00±9.27 203.86±35.25 38.50±9.39肝纖維化模型組 5.80±0.66* 811.09±475.96* 1791.17±528.19* 545.18±173.04* 330.58±160.62*肝蘇干預組低劑量5.60±0.69* 462.71±460.49* 534.67±501.89# 420.89±143.90* 171.58±74.68*#中劑量 5.36±0.58* 527.50±359.95* 934.00±598.56*# 346.75±166.50*# 122.41±108.62#高劑量 5.78±0.65* 363.00±270.62# 523.33±853.83# 309.11±65.78# 116.00±83.59#例數7 14體質量增加（g）167.4±26.1 87.4±34.0*10 12 10 110.1±34.0*98.2±40.9*97.6±28.6*

二、各組大鼠血清學指標比較

肝纖維化模型組血清 ALT、AST、ALP、HA水平較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。高劑量肝蘇干預組血清ALT水平、高、中劑量肝蘇干預組血清ALP水平、各劑量肝蘇干預組血清AST、HA水平較肝纖維化模型組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表 1）。

三、各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性比較

肝纖維化模型組肝組織MDA含量較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。各劑量肝蘇干預組均較肝纖維化模型組下降，高、中劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。各組間肝組織SOD活性無明顯差異（見表 2）。

表2 各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性比較（±s ）

表2 各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性比較（±s ）

*與正常對照組比較，P＜0.05；#與肝纖維化模型組比較，P＜0.05

組 別 例數 MDA（nmol/mg蛋白） SOD（U/mg蛋白）正常對照組 7 1.13±0.13 124.85±15.83肝纖維化模型組 14 2.07±0.43* 115.34±21.43肝蘇干預組低劑量 10 1.77±0.33* 98.42±11.06中劑量 12 1.33±0.34# 116.10±29.04高劑量 10 1.26±0.13# 116.38±20.79

四、各組大鼠肝纖維化程度比較

各組大鼠肝組織HE和Masson染色均可見纖維組織（見圖1、圖2）。正常對照組肝小葉結構完整，無肝細胞脂肪變性或壞死，無炎癥細胞浸潤和纖維組織增生。肝纖維化模型組肝小葉結構破壞，小葉周圍肝細胞明顯壞死，纖維組織增生、假小葉形成，肝細胞明顯腫脹變性，尤以脂肪變性為甚，部分肝細胞可見氣球樣變。各劑量肝蘇干預組肝組織未見明顯假小葉，僅少量纖維組織增生，多局限于門管區，肝細胞以脂肪變性、壞死為主。

圖1 各組大鼠肝組織纖維化程度比較（HE染色，×100）

各組大鼠肝纖維化分期比較示Kruskal-Wallis檢驗H值為8.370，組間總體差異有統計學意義（P=0.039）。各劑量肝蘇干預組纖維化分期均較肝纖維化模型組明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.05），尤以高劑量組為著（見表 3）。

圖2 各組大鼠肝組織纖維化程度比較（Masson染色，×100）

表3 各組大鼠肝纖維化分期比較（n）

五、各組大鼠肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量比較

免疫組化染色示正常對照組α-SMA僅表達于小動脈、小靜脈血管上皮細胞胞質。肝纖維化模型組α-SMA大量表達于門管區、纖維間隔的HSC胞質，染色面積較正常對照組顯著增多（P＜0.05）。各劑量肝蘇干預組α-SMA主要表達于門管周圍散在分布的HSC胞質，染色面積較肝纖維化模型組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖 3、表 4）。

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA免疫組化染色圖（×100）

圖4 各組大鼠肝組織Ⅰ型膠原免疫組化染色圖（×100）

免疫組化染色示正常對照組肝組織Ⅰ型膠原主要表達于中央靜脈、門管區、門管間纖維組織，Ⅲ型膠原除上述區域外，尚表達于竇周。肝纖維化模型組Ⅰ型、Ⅲ型膠原除表達于中央靜脈、門管區、竇周外，尚沿纖維間隔彌漫分布，染色面積均較正常對照組顯著增多（P<0.05）。各劑量肝蘇干預組Ⅰ型、Ⅲ型膠原主要表達于中央小葉和門管周圍，少量表達于纖維間隔，染色面積較肝纖維化模型組明顯減少，Ⅰ型膠原各劑量組差異均有統計學意義（P<0.05），Ⅲ型膠原僅高劑量組差異有統計學意義（P<0.05）（見圖 4、圖 5、表 4）。

圖5 各組大鼠肝組織Ⅲ型膠原免疫組化染色圖（×100）

表4 各組大鼠肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原染色面積比較（±s，%）

表4 各組大鼠肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原染色面積比較（±s，%）

*與正常對照組比較，P＜0.05；#與肝纖維化模型組比較，P＜0.05

組 別 例數 α-SMA Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原正常對照組 7 1.08±0.53 0.64±0.21 0.72±0.34肝纖維化模型組 14 9.48±2.51* 8.29±2.86* 5.21±1.56*肝蘇干預組低劑量 10 5.64±1.93*#4.22±1.40*#4.26±1.61*中劑量 12 4.59±2.26*#3.16±1.18*#4.12±1.53*高劑量 10 3.87±1.66*#2.70±0.92*#3.59±1.70*#

討 論

肝纖維化是諸多肝病的中間環節，如不予有效治療，可最終進展為肝硬化，甚至肝癌、肝衰竭。當前觀點認為肝纖維化進程可逆，預防和治療肝纖維化是肝病防治的重要環節[6,7]。CCl4為選擇性肝毒性藥物，可致肝小葉中央靜脈周圍細胞壞死、纖維增生，CCl4大鼠肝纖維化模型是目前國內外較常采用的動物模型之一，適用于肝纖維化發生、發展的動態觀察和研究[8 ～ 10]。本研究結果證實CCl4可成功誘導大鼠肝纖維化模型，模型大鼠血清ALT、AST、ALP水平較正常對照組顯著升高，提示存在明顯肝細胞損傷。

肝蘇為中藥扯根菜的成方制劑，包括槲皮素、沒食子酸、喬松素等成分。Molina等[11]的研究顯示槲皮素可通過直接抑制脂質過氧化、間接促進抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的產生以保護小鼠肝臟免受氧化應激損傷。Renugadevi等[12]的研究發現槲皮素能緩解鎘所致的大鼠腎毒性和氧化應激損傷。Liu等[13]的研究亦證實槲皮素可恢復抗氧化酶活性，減少氧化應激誘導的DNA損傷和細胞凋亡。此外，有研究[14,15]發現沒食子酸可激活肝微粒體谷胱甘肽-S轉移酶活性，防止自由基對肝細胞微粒體的損傷。上述研究提示肝蘇在保護肝細胞免受氧化應激損傷方面有一定應用前景。本研究結果示各劑量肝蘇干預組血清ALT、AST、ALP水平均有不同程度的改善，提示肝蘇可通過抗氧化作用減輕肝細胞壞死，從而保護肝細胞，改善肝功能。

CCl4大鼠肝纖維化模型研究提示肝內脂肪本身與HSC的活化和膠原生成無關，但可通過增強CCl4對肝臟的脂質過氧化損傷促進肝纖維化發生。MDA是脂質過氧化的重要終產物之一，可反映機體受氧自由基攻擊的嚴重程度，SOD則反映機體清除氧自由基的能力，兩者與HSC增殖和肝纖維化的發生、發展密切相關[16]。本研究結果示高、中劑量肝蘇干預組肝組織MDA含量顯著下降，但各組間SOD活性無明顯差異，提示肝蘇可能通過直接降低MDA含量以延緩肝纖維化的發生，此過程不伴SOD活性的改變。

肝纖維化由細胞外基質過度增生并在肝內異常沉積所致，膠原纖維是細胞外基質的主要成分，膠原合成、沉積與降解、吸收間動態平衡的破壞是造成肝纖維化的主要原因[17,18]。Ⅰ型、Ⅲ型膠原占總膠原含量的80% ～ 90%[19]，因此觀察兩者的變化可間接評價肝纖維化程度，亦可用于藥物抗肝纖維化療效的評估。本研究結果示各劑量肝蘇干預組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量均較肝纖維化模型組有所下降，與肝組織病理學檢查纖維化分期結果一致，Ⅰ型膠原含量在各劑量干預組中均顯著下降，Ⅲ型膠原含量僅在高劑量干預組中顯著下降，由此提示肝蘇可明顯改善大鼠肝纖維化，尤以高劑量組作用為著。此外，本研究結果示各劑量肝蘇干預組血清纖維化指標HA水平均較肝纖維化模型組顯著下降，與肝組織病理學和Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量檢查結果一致。

HSC活化和增殖是肝纖維化形成的中心環節[20,21]。肝細胞損傷可激活HSC，使其由靜息狀態活化為肌纖維樣母細胞，表達活化標記物α-SMA，并大量合成細胞外基質。本研究結果示肝纖維化模型組肝組織大量表達α-SMA，提示HSC活化；各劑量肝蘇干預組α-SMA含量顯著減少，即活化的HSC減少，由此提示肝蘇可能通過抑制HSC活化以減少膠原沉積，改善肝纖維化，并進一步提示抑制HSC活化有望成為延緩肝纖維化進程的關鍵環節。

綜上所述，本研究結果示肝蘇能減輕實驗性大鼠肝纖維化的肝細胞損傷，降低肝組織MDA含量，抑制HSC活化和肝內膠原合成，具有抗氧化和抗纖維化作用，但其具體機制有待進一步研究證實。

1 黃加權,袁萍,黃鐵軍,等.肝蘇顆粒對實驗性黃疸大鼠肝功能的保護及其機制.中華傳染病雜志,2007,25(3):143-146.

2 陳曉蓉,姚華,蔣音,等.肝蘇顆粒治療慢性乙型肝炎的療效觀察.中華肝臟病雜志,2004,12(1):50.

3 劉梅,竇愛霞,陳尉華,等.肝蘇對人肝細胞和肝星狀細胞增殖、氧應激以及細胞外基質表達的影響.胃腸病學,2009,14(6):347-350.

4 陸倫根,房靜遠.肝纖維化.見:高春芳,陸倫根主編.纖維化疾病的基礎和臨床.上海:上海科學技術出版社,2004.359-364.

5 中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華肝臟病雜志,2000,8(6):324-329.

6 Povero D,Busletta C,Novo E,et al.Liver fibrosis:a dynamic and potentially reversible process.Histol Histopathol,2010,25(8):1075-1091.

7 Pinzani M,Rombouts K.Liver fibrosis:from the bench to clinical targets.Dig Liver Dis,2004,36(4):231-242.

8 Desmyter L,Fan YD,Praet M,et al.Rating of CCl(4)-induced rat liver fibrosis by blood serum glycomics.J Gastroenterol Hepatol,2007,22(7):1148-1154.

9 Huang Q,Xie Q,Shi CC,et al.Expression of angiotensin-converting enzyme 2 in CCL4-induced rat liver fibrosis.Int JMol Med,2009,23(6):717-723.

10 Muriel P,Moreno MG,Hernández Mdel C,et al.Resolution of liver fibrosis in chronic CCl4 administration in the rat after discontinuation of treatment:effect of silymarin,silibinin,colchicine and trimethylcolchicinic acid.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2005,96(5):375-380.

11 Molina MF,Sanchez-Reus I,Iglesias I,et al.Quercetin,a flavonoid antioxidant,prevents and protects against ethanol-induced oxidative stress in mouse liver.Biol Pharm Bull,2003,26(10):1398-1402.

12 Renugadevi J,Prabu SM.Quercetin protects against oxidative stress-related renal dysfunction by cadmium in rats.Exp Toxicol Pathol,2010,62(5):471-481.

13 Liu CM,Ma JQ,Sun YZ.Quercetin protects the rat kidney against oxidative stress-mediated DNA damage and apoptosis induced by lead.Environ Toxicol Pharmacol,30(3):264-271.

14 Shinno E,Shimoji M,Imaizumi N,et al.Activation of rat liver microsomal glutathione S-transferase by gallic acid.Life Sci,2005,78(1):99-106.

15 Rasool MK, Sabina EP, Ramya SR, et al.Hepatoprotective and antioxidant effects of gallic acid in paracetamol-induced liver damage in mice.J Pharm Pharmacol,2010,62(5):638-643.

16 Apte M.Oxidative stress:does it ‘initiate’ hepatic stellate cell activation or only ‘perpetuate’ the process?JGastroenterol Hepatol,2002,17(10):1045-1048.

17 Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Gastroenterology,2008,134(6):1655-1669.

18 Parsons CJ,Takashima M,Rippe RA.Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis.J Gastroenterol Hepatol,2007,22(Suppl 1):S79-S84.

19 洪微,朱元杰.纖維化中幾種重要的細胞外基質.見:高春芳,陸倫根主編.纖維化疾病的基礎和臨床.上海:上海科學技術出版社,2004.3-20.

20 Li JT,Liao ZX,Ping J,et al.Molecular mechanism of hepatic stellate cell activation and antifibrotic therapeutic strategies.JGastroenterol,2008,43(6):419-428.

21 吳盛迪,王吉耀.抗肝纖維化治療研究進展.肝臟,2009,14(1):71-73.