前體MRNA可變剪接調節因子NSSR1在大腸癌中的表達

張 薇，沈 權，沈嘉希

(浙江大學城市學院醫學與生命科學學院，浙江杭州310015)

NSSR1(neural salient SR protein 1)是一種新近發現的 SR(serine/arginine-rich)蛋白［1］，具有經典的SR蛋白結構特點，即N端有1個RBD(RNA binding domain)結構域，C端有3個包含Ser-Arg重復序列的RS結構域。RBD結構域可以識別mRNA序列，而RS結構域可以進行蛋白-蛋白作用［2］。研究證明，在哺乳動物中SR蛋白除了可以參與正常的前體mRNA剪接過程，還在相關的疾病中與前體mRNA的異常剪接有關，如在 SMA(spinalmuscular atrophy)中，Tra2β1(transformer 2β1)可以促進SMN2全長型蛋白的表達［3］，而在乳腺癌中Tra2β1可以促進CD44的v4以及v5外顯子的摻入，這提示其可能在乳腺癌的發生及轉移中發揮作用［4］。我們最近的研究［5］發現，NSSR1在子宮內膜癌中存在高表達。然而，有關SR蛋白在大腸癌細胞中的表達以及其對前體mRNA可變剪接調控的研究目前在國際上報道極少，其中Filippov等［6］發現，在培養的大腸癌細胞中存在 SRp55的表達;Goncalves等［7］發現，ASF/SF2以及 SRp20在調控Rac1b基因的3號外顯子中發揮作用;Thorsen等［8］發現，SRSF1在調控SLC39A14基因的4a/4b外顯子中發揮作用。

本研究通過RT-PCR、Western blot以及免疫組織化學染色等方法觀測NSSR1在小鼠大腸和人大腸癌組織中的表達，為探討NSSR1在大腸癌發生發展中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 RT-PCR 成年昆明種小鼠購自復旦大學上海醫學院動物房，經戊巴比妥鈉麻醉后斷頸處死，迅速摘取各組織器官，小鼠的大腦組織經從枕骨大孔處剪開并分離獲得。RT-PCR分析:組織樣品在冰上經研磨后，加入Trizol試劑并按說明書要求抽提各組織樣品總RNA，然后，以Oligo-dT18為引物，用M-MLV逆轉錄酶按說明書要求進行逆轉錄反應，將所得到的cDNA作為模板進行PCR分析。NSSR1引物序列:正向 (5＇-GGAATGTCCCGCTACCTGCGT)，反向(5＇-CTTGTGGCCACTGGACTTAGG-3＇);反應條件:(94℃，5 min)–(94℃，30 s;55℃，30 s;72℃，40 s;25 ～30 個循環)–(72℃，5 min)。PCR產物用1%瓊脂糖膠電泳分離，凝膠成像系統拍照(上海復日公司)，然后用Totallab軟件進行條帶亮度分析并統計結果。

1.2 Western blot 首先在組織樣品中加入適量的裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1%NP-40，10%PMSF)，在冰浴上勻漿，放置20 min以裂解細胞，離心(13 000 r/min，15 min)，取上清，經考馬斯亮藍染色法定量后，加入等體積2×上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8;200 mmol/L DTT，4 g/L SDS，2 g/L 溴酚藍，20%甘油)，混勻，100℃ 水浴煮沸 15 min，冰上冷卻后，經10%SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電泳分離蛋白，并轉移到硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉/TBS室溫封閉1 h，以兔抗人 NSSR1抗體(1∶500稀釋，由本實驗室自制［9］)為一抗，4℃結合過夜，TBS洗3次后，加入堿性磷酸酶(AP)標記的羊 抗兔 IgG(Sigma，St Louis，Missouri，USA)為二抗，室溫結合 1h，TBS 洗 3次后以BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium，上海鼎國)為底物顯色。

1.3 免疫組織化學SABC法染色 大腸癌標本來自復旦大學附屬中山醫院2003年5月-2006年7月手術切除并經病理證實的大腸癌患者，其中男性8例，女性5例，年齡25～69歲(平均38歲)。取瘤旁正常組織作為對照。所有臨床標本均常規石蠟包埋，作連續切片，厚度為3 μm。所有切片均作免疫組織化學SABC法染色，兔抗人NSSR1抗體同上，其余試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，包括SABC試劑盒、DAB顯色劑等。載玻片防脫片劑處理:選用 APES，撈片后置烤箱(58℃ ～60℃)60 min以使切片緊密黏附，切片脫蠟至水。蒸餾水新鮮配置3%H2O2，室溫10 min以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。微波修復抗原:將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH 6.0，電爐加熱到沸騰后斷電，間隔5～10 min，反復2～3次。冷卻后進行下一步。滴加正常血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。滴加適當稀釋的一抗，溫箱37℃孵育60 min，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，溫箱37℃孵育20 min。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，37℃孵育20 min。PBS洗5 min×4次。DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，將試劑盒中A、B、C試劑各l滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在5-30 min之間。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。

2 實驗結果

2.1 NSSR1在小鼠各組織中的表達 在正常小鼠的大腦、小腦、心臟、肝臟、大腸以及肺等組織中，均存在NSSR1的mRNA表達，且各組織中的表達均比較接近包括大腸(圖1A)。而NSSR1蛋白只在小鼠大腦和小腦中有表達，其余各組織包括大腸均無表達(圖1B)，該結果說明NSSR1的表達具有組織特異性，在正常的腸道組織中，只存在 NSSR1的 mRNA表達，NSSR1蛋白的表達很少或不表達。

2.2 NSSR1在人類大腸癌中的表達 免疫組織化學結果顯示(圖2)，在正常的對照大腸組織中，NSSR1只在靠近腸腔的黏膜上皮細胞中有表達(如箭頭所示)，且主要在細胞核中表達，其在黏膜腺體中無表達。然而，在大腸癌組織中NSSR1均存在顯著表達，而且主要表達于腫瘤細胞核中，在胞漿中呈弱陽性。

3 討論

大腸癌是一種嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤。近年來隨著生活條件及飲食結構的改變，在我國有明顯上升的趨勢，每年新增病例約25萬，占惡性腫瘤發病率的第4位，其中在發達地區已上升到第3位。因此研究大腸癌的病理發生發展機制有十分重要的意義。目前許多研究發現，在大腸癌中存在多種基因的異常可變剪接亞型，而異常的前體mRNA可變剪接可能在大腸癌的發生發展中扮演重要角色。Thorsen等［8］發現，在大腸癌中鋅離子轉運蛋白 SLC39A14(solute carrier family 39，member 14)基因的 4A及4B外顯子存在異常剪接;Wu等人發現，eIF 4H(eukaryotic translation initiation factor 4H)在大腸癌中也存在異常的可變剪接，且該剪接亞型與腫瘤的發生有關［10］;而 Antonacopoulou等［11］發現，survivin在大腸癌中存在異常的可變剪接亞型。因此，相關基因的異常剪接在大腸癌的發生、惡化以及轉移等方面可能發揮重要作用。

圖1 NSSR1在小鼠各組織中的表達Fig.1 Theexpression ofNSSR1 in mouse tissues

圖2 NSSR1在人類大腸癌中的表達Fig.2 The expression of NSSR1 in human colorectal cancer

NSSR1作為一種在神經系統內顯著表達的SR蛋白，主要分布在小鼠及人體神經組織中，如大腦神經元、小腦浦肯野氏細胞、視網膜雙極細胞等，在神經細胞的發育分化中具有重要功能［12］。此外，NSSR1 可以調控 AMPA(alpha amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)受體亞單位GluR-B(glutamate receptor subunit B)、NCAML1，Trk c等基因的可變剪接。在細胞分裂間期以及熱休克時，去磷酸化的NSSR1可以抑制前體mRNA的剪接發生，從而對防止錯誤剪接的產生具有重要意義［13-14］。而 Yang 等［15-16］的研究發現，NSSR1可以同TLS(translocated in liposarcoma)、EWS/FLI-1(ewing sarcoma protein/friend leukemia integration site 1)等蛋白作用，而 TLS、EWS等都是腫瘤相關蛋白，這從一個側面反映了NSSR1可能在腫瘤的發生及發展中扮演角色。

目前，NSSR1是否在人類的腸道中有表達尚不清楚，本研究用RT-PCR和Western blot方法觀測了在模式動物小鼠腸道以及其它組織中的表達情況，結果顯示，NSSR1的mRNA在小鼠的各組織中均有表達，而蛋白只在神經系統表達，在腸道中無表達。在人體正常腸道組織中，NSSR1只在腸黏膜上皮細胞中表達;而在大腸癌細胞中NSSR1存在顯著表達，而且主要分布在細胞核中。這一結果進一步提示NSSR1可能在腫瘤的發生、惡化以及轉移中發揮作用。NSSR1在正常大腸組織的黏膜上皮細胞中有表達，這可能與上皮組織具有較強的再生能力有關，這些上皮細胞更新較快，因此細胞轉錄活性很高，需要較多的剪接因子表達以調控轉錄過程中的可變剪接。

總之，本研究結果顯示NSSR1在大腸癌細胞中存在高表達，至于NSSR1的高表達在大腸癌的發生以及發展中有何生物學意義，是否可以通過調控相關的目標基因的可變剪接進而影響大腸癌的發生發展以及轉移，其目標基因有哪些，調控機制如何，將是我們在接下來的研究中所需要解決的問題。

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