硫化氫預處理延遲相對大鼠心肌缺血再灌注時谷胱甘肽S轉移酶表達的影響

冉 珂，唐正國，丁麗萍，李雙鳳，常業恬

(1.中南大學湘雅二醫院麻醉科，湖南長沙410011;2.長沙市第三醫院麻醉科，湖南長沙410015)

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發現的第3個內源性氣體信號分子，參與機體許多生理和病理過程的調節。有研究表明，H2S預處理延遲相對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用［1］，但是其保護機制目前尚未完全闡明。谷胱甘肽S轉移酶(GST)在體內具有抗氧化的作用，能催化細胞內的谷胱甘肽與多種親電子底物結合，使體內代謝生成的氧化物失活，使細胞免受其細胞毒性作用。H2S預處理延遲相對心肌缺血再灌注損傷的保護作用是否與GST有關目前未見報道。因此，本研究擬探討H2S預處理延遲相對大鼠心肌缺血再灌注時谷胱甘肽S轉移酶表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠40只，體重300～350 g，由湖南斯萊景達實驗動物有限公司提供。

1.2 儀器設備 DH150呼吸機系浙江大學醫學儀器廠生產;H-7500透射電子顯微鏡系日本日立公司產品;MD100-2電子分析天平系上海天平儀器廠生產;CH30光學顯微鏡系日本OLYMPUS公司產品;光學顯微鏡和攝影系統系德國CCD系統;全自動生化分析儀系美國BECKMAN公司產品;內切式勻漿機系中山大學中山醫學院儀器廠產品;5415R型高速低溫臺式離心機系德國Eppendorf公司產品;721分光光度儀系上海第三分析儀器廠產品;恒溫水浴箱系上海儀器廠產品;-70℃冰箱系日本松下公司產品;壓力換能器系美國惠普公司產品;450 nm酶標儀為日本BIO-RAD Model 550型;電轉印裝置系美國Pharmcia Nova Blot公司產品;恒溫震蕩器為北京醫療設備廠生產;計算機圖像分析系統系美國UVP uplang公司產品。

1.3 試劑 硫氫化鈉(NaHS)、5-羥葵酸(5-HD)、伊文思藍、氯化硝基四氮唑藍、戊巴比妥鈉均為美國Sigma公司產品，丙烯酰胺、無水乙醇、異丙醇、氯仿、二甲苯等均為國產試劑。

1.4 方法

1.4.1 缺血再灌注模型的制備 參考文獻［2-3］方法制備兔缺血再灌注模型。

1.4.2 動物分組 將40只健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠隨機分成4組:假手術組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、硫化氫組(H組)和硫化氫預處理延遲相+線粒體KATP通道阻斷劑5-HD組(D組)，每組10只。S組僅開胸并分離冠狀動脈左前降支，但不阻斷血流150 min;IR組行冠狀動脈左前降支阻斷30 min，再灌注120 min;H組靜脈注射NaHS 0.05 mg/kg，給藥后24 h同IR組處理，D組缺血前15min靜脈注射5-HD 5 mg/kg，其它同H組處理。

1.5 心肌梗死面積測量 實驗結束立刻重新阻斷左冠前降支并從尾靜脈注入1%伊文思藍2 ml，充分染色后取出心臟。分離左心室(包括室間隔)，濾紙吸干后將心臟放在-20℃冰箱10 min后取出，切片，每片厚約1～2 mm，血供正常心肌呈藍染，缺血區心肌呈紫紅或蒼白，缺血心肌與正常心肌比值即為缺血危險區，將心肌置于37℃ 10%TTC中水浴15 min，氧化還原反應后存活心肌呈藍色，梗死心肌呈蒼白色，危險區心肌呈紅色。4%甲醛固定24 h后，每個心臟切片進行數碼照相，取左心室稱重。左心室(left ventricle，LV)、缺血區(area at risk，AAR，非藍色區)和心肌梗死區(infarct size，IS，灰色區)面積用Image-Pro Plus 5.0軟件計算。梗死心肌重量計算:梗死心肌重量=(A1×W1)+(A2×W2)+(A3×W3)+(A4×W4)+(A5×W5)(A:梗死心肌面積占左心室面積的百分比;W:心臟切片的重量;1～5:心臟切片編號)。心肌缺血區重量按類似的方法計算;心肌缺血區范圍用心肌缺血區重量占左心室重量百分比(AAR/LV×100)表示;心肌梗死范圍用心肌梗死區重量占心肌缺血區重量百分比(IS/AAR×100)表示。

1.6 心肌組織病理學檢查 再灌注結束后，分別取各組心尖區心肌組織1 mm×1 mm×1 mm在透射電鏡下行超微結構檢查。

1.7 心肌GST的測定 采用免疫印跡分析，在再灌注120 min結束即刻，取左心室前壁心肌組織提取蛋白，并于 -70℃儲存備用。取100 μg心肌蛋白于12.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離的心肌蛋白隨后通過電轉印裝置轉印至PVDF膜，在封閉液中室溫作用3 h。再加入GST抗體，4℃孵育過夜，用TTBS緩沖液沖洗15 min×4次后，加入二抗羊抗鼠IgG，室溫搖動孵育1 h，再用TTBS緩沖液充分沖洗，最后進行增強化學發光反應。結果用GIS-700D型凝膠圖像系統進行掃描分析，記錄平均光密度值表示心肌GST的表達。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件分析。所有數據采用均數±標準差(±s)表示，多組均數間比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌超微結構變化 S組心肌細胞結構正常，排列整齊，線粒體形態正常;IR組心肌細胞水腫，心肌纖維排列模糊、紊亂，線粒體嚴重腫脹、空泡化;H組線粒體基質顆粒部分消失、嵴排列欠整體、少部分斷裂，肌絲結構基本完整、排列欠清晰。與IR組相比，H組線粒體損傷程度明顯減輕;D組與IR組的電鏡圖像差異不大(圖1)。

圖1 電鏡下各組心肌細胞形態學改變Fig.1 Each group＇s pathological changes of cardiac cells under the electron microscopy

2.2 各組心肌梗死面積變化 除S組外，其余3組心肌缺血面積無明顯差異(P＞0.05);心梗面積與IR組比，H組明顯降低(P＜0.05)，D組無明顯差異(P＞0.05)，見表1和圖2。

2.3 各組大鼠心肌GST的表達 與S組(34.8±4.2)比較，IR 組(94.2±5.4)、H 組(188.7±7.1)和 D組(92.5±6.8)表達均上升(P＜0.05);與IR組比較，H組表達上升(P＜0.05)，D組表達無明顯差異(P＞0.05)，見圖3。

圖2 大鼠左室心肌Evan＇s Blue與TTC染色后切片Fig.2 The slice of myocardium of the rat ventriculus sinister under staining of Evan＇s Blueand TTC

表1 各組心肌缺血面積及心梗面積的比較Table 1 The changes of infarct area and area at risk in each group(n=7，±s，%)

表1 各組心肌缺血面積及心梗面積的比較Table 1 The changes of infarct area and area at risk in each group(n=7，±s，%)

與IR組比，*P＜0.05.

組別 缺血面積 心梗面積S組00 IR組 44.16±6.88 38.27±5.64 H組 45.03±6.04 25.40±3.54*D組 43.25±6.69 40.53±5.24 F=0.41 F=18.34 P＞0.05 P ＜0.01

圖3 各組大鼠心肌GST蛋白表達Fig.3 Western blot products of GST expression of each group

3 討論

H2S在體內可能有兩種存在形式:1/3以氣體H2S形式，2/3可能以NaHS形式存在。NaHS在體內可解離成鈉離子和硫氫根離子，后者與體內氫離子結合生成H2S，H2S與NaHS在體內形成一種動態平衡。NaHS溶液與內源性H2S體內的存在方式相似，是一種較理想的外源性硫化氫供體。Elrod等［4］在研究NaHS 5～50 μg/kg預處理延遲相早期相對心肌的保護機制中發現，以50μg/kg的NaHS保護作用最強，因此本實驗采用IR前24 h給予NaHS 50 μg/kg預處理的方案。

心肌梗塞面積測量是國際公認的評價心肌缺血損傷的金指標，TTC染色法是公認的檢測早期心肌細胞不可逆損傷的最可靠而靈敏的方法［5-6］。在本研究中，IR組和H組的缺血面積無顯著性差異，表明LAD阻斷效果肯定，各組LAD阻斷部位基本一致。與IR組比，H組心梗面積明顯降低，提示硫化氫預處理延遲相能顯著減輕心肌損傷程度。

GST屬于可溶性同工酶超基因家族，包括GSTA、GSTM、GSTT和GSTP等，同工酶能催化谷胱甘肽與多種親電子底物結合。外源性異物在體內代謝生成高度活化的氧化物，產生細胞毒性，而GST可以催化這些代謝產物使之失活，使細胞免受其細胞毒性作用，因此GST在體內具有抗氧化作用。H2S是一種高反應性氣體分子，很容易與氣體化合物反應，特別是活性氧簇(ROS)、活性氮簇(RNS)。研究證實H2S可以與超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、過氧亞硝酸鹽(ONOO-)、次氯酸鹽(CLO-)等活性氧、活性氮發生化學反應［7-10］，從而阻止了由活性氧/活性氮介導的對細胞蛋白質和磷脂的氧化損傷。Rao 等［11］采用 水 飛薊素(silymarin)干預心肌缺血再灌注損傷，發現GST在水飛薊素預處理心肌中表達上調，認為可能通過促進GST等抗氧化還原酶的高表達和提高其活性而發揮心肌保護作用。Lyn等［12］采用基因組學技術研究缺血引起的心肌細胞基因的變化，發現在缺血后的心肌重塑過程中，同時伴隨著GST基因的高表達。

本研究采用免疫印跡法檢測心肌GST的表達，結果發現GST在硫化氫組心肌組織中顯著增高，提示H2S預處理延遲相通過上調GST的表達來提高心肌抗氧化損傷的能力，從而發揮心肌延遲保護作用。

本研究中，選擇性線粒體KATP通道阻斷劑5-HD取消了H2S預處理延遲相對缺血再灌注心肌損傷的保護作用，提示線粒體KATP通道介導了H2S預處理對缺血再灌注心肌的保護作用。同時發現，5-HD取消了H2S預處理延遲相對心肌GST表達的影響，提示線粒體KATP通道介導了H2S預處理延遲相對心肌GST表達的影響。

總之，本研究結果提示H2S預處理延遲相對大鼠缺血再灌注心肌具有保護作用，這與上調心肌GST的表達有關。

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