文拉法辛對卒中后抑郁大鼠學習記憶及海馬腦源性神經營養因子的影響

代沐華，李德強，韓 陽

(浙江大學醫學院附屬第一醫院，浙江杭州310003)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后常見的并發癥，發生率高達25% ～79%［1］。大量研究表明，PSD不僅降低卒中患者的生活質量，而且影響疾病的康復以及誘發再次卒中的可能。研究發現，35% ～82% 的卒中患者伴隨至少某一方面的認知障礙，這些認知障礙不但影響卒中患者的預后［2］，而且增加患者負擔［3-4］。鹽酸文拉法辛是臨床一線的抗抑郁藥物，其抗抑郁療效優于選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑［5-6］，對伴焦慮［7］及以軀體不適為主的抑郁患者療效確切，但其在卒中后抑郁治療方面的研究報道較少，尚未見對卒中后抑郁認知障礙改善的報道。

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及其基因多態性不僅與抑郁障礙的發生有關［8-9］，而且與學習記憶障礙情況下海馬的病理改變相關。本研究擬采用選擇性右側大腦中動脈栓塞與慢性不可預見性溫和應激相結合的方法建立卒中后抑郁大鼠模型，用Morris水迷宮試驗評價學習記憶功能，探討鹽酸文拉法辛對模型大鼠學習記憶的影響及海馬CA3區BDNF表達變化的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 選取清潔級SD雄性大鼠50只，體重250～300 g，隨機均分為5組:對照組、模型組和3個文拉法辛治療劑量組(5 mg·kg-1治療組、10 mg·kg-1治療組及 20 mg·kg-1治療組)。依據文獻［10］，用線栓法行右側大腦中動脈栓塞手術后接受連續3周的慢性不可預見性溫和應激，建立卒中后抑郁模型;用糖水偏愛試驗評價抑郁模型的可靠程度。糖水偏愛試驗評價參照有關文獻［11］，用糖水消耗比例表示(糖水消耗量/總液體消耗量×100)。3個治療劑量組的大鼠在進行慢性應激處理期間，在固定時段(21:00-22:00)每日1次腹腔內注射鹽酸文拉法辛(美國惠氏制藥有限公司)，劑量分別為:5 mg·kg-1·d-1，10 mg·kg-1·d-1及 20 mg·kg-1·d-1。藥物治療結束后所有大鼠進行Morris水迷宮試驗。行為學觀察結束后，大鼠經10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，斷頭處死，取腦組織置入4%多聚甲醛固定24 h，經海馬矢狀切片，片厚5 μm，用SABC試劑盒行BDNF組織化學染色。

1.2 學習記憶測試 Morris水迷宮實驗是經典的用于測定海馬依賴的學習與記憶的方法，該系統主要包括直徑150 cm、高50 cm的圓形水池，水池分為4個象限，每一象限中置一平臺，平臺直徑9 cm，高24 cm，水面高于平臺1～2 cm，水溫(22±1)℃，水池正上端設計視頻攝像頭，附帶視頻攝像系統及分析軟件。大鼠訓練程式參照有關文獻［12］，進行定位航行實驗及空間探索實驗。定位航行實驗用于測試學習功能，空間探索實驗用于測試記憶功能。在進行定位航行實驗時，每天將大鼠分別從不同象限頭面向池壁投入水中，計算機自動跟蹤并分析大鼠尋找平臺的潛伏期，如果120 s仍未找到平臺，則人為引導到平臺并停留30 s，此時逃避潛伏期記錄為120 s。連續訓練5 d，每天訓練4次(分別從不同的象限入水)，每次間隔10 min。將每天記錄的4次逃避潛伏期取平均值，作為大鼠當天的學習指標。5 d訓練結束后，撤除平臺，進行空間探索實驗。將大鼠放入任一象限，分析60 s內大鼠在平臺所在象限的停留時間(空間探索時間)和跨平臺次數，作為記憶能力的評價指標。

1.3 海馬免疫組織化學觀察與BDNF陽性細胞計數 所用試劑均購自武漢博士德公司。一抗為兔抗鼠BDNF單克隆抗體，按1∶100稀釋;二抗為生物素化羊抗兔IgG，即用型SABC試劑盒。嚴格按試劑盒說明操作。選取經過相同水平部位的海馬切片，在400倍顯微鏡下觀察并計數CA3區4個不同視野的陽性細胞數，取平均值進行統計分析。

2 結果

本實驗中由于意外及術后感染等原因共死亡9只大鼠，其中模型組2只，5mg·kg-1治療組3 只，10 mg·kg-1治療組 3 只，20 mg·kg-1治療組1只。

2.1 各組大鼠糖水偏愛比較 PSD模型組大鼠從接受慢性應激的第1周末一直到第3周末糖水偏愛均低于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。5 mg·kg-1治療組在應激第2周末，10 mg·kg-1治療組及 20 mg·kg-1治療組在應激第1周末糖水偏愛與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。說明本研究使用的卒中后抑郁模型是成功和有效的，經過文拉法辛治療，PSD大鼠糖水偏愛的提高進一步證明了模型的可靠性，但是，3個治療組間差異無統計學意義(表1)。

表1 各組大鼠糖水偏愛比較Table 1 Comparison of sucrose preference among five groups

2.2 各組大鼠逃避潛伏期比較 自訓練第2天開始，PSD組逃避潛伏期顯著高于同時點的對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，表明PSD大鼠學習能力顯著下降。PSD大鼠經5 mg·kg-1藥物治療后，于訓練的第4天逃避潛伏期出現顯著的下降，學習能力改善。10 mg·kg-1治療組及20 mg·kg-1治療組與模型組比較均自訓練的第2天起即出現逃避潛伏期的顯著下降，其作用明顯高于同時段的5 mg·kg-1治療組，差異具有統計學意義(表2)。

表2 各組大鼠逃避潛伏期比較Table 2 Comparison of escape latency time among five groups

2.3 各組大鼠空間探索時間和跨平臺次數比較 五組大鼠間比較空間探索時間及跨平臺次數均具有統計學差異(P＜0.05)，PSD大鼠記憶功能受損最明顯，經過文拉法辛5 mg·kg-1、10 mg·kg-1及 20 mg·kg-1治療后，PSD大鼠的記憶功能顯著提高(表3)。10 mg·kg-1及20 mg·kg-1治療組的療效優于5 mg·kg-1治療組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。由于空間探索時間和跨平臺次數測評結果與大鼠的運動活性明顯相關，本研究進一步分析了大鼠在定位航行實驗及空間探索實驗中的游泳速度，結果發現模型組大鼠與對照組比較，自訓練第3天游泳速度開始顯著下降(P＜0.05)，一直持續到記憶測試完成。10 mg·kg-1及20 mg·kg-1的文拉法辛對PSD大鼠運動激活作用明顯，在定位航行試驗的第3天就表現出統計學差異，而5 mg·kg-1組在第5天出現統計學意義的差異，在定位航行試驗的第3天起，20 mg·kg-1治療組即高于同時點的5 mg·kg-1組，差異具有統計學意義(表4)。

表3 各組大鼠空間探索時間及跨平臺次數比較Table 3 Comparison of spatial exploring time and frequency of spanning among five groups

表4 各組大鼠在定位航行實驗及空間探索實驗中平均速度比較Table 4 Comparison of the average speed in place navigation and spatial probing test among five groups

2.4 各組大鼠BDNF陽性細胞觀察及計數結果 BDNF陽性表達為棕色斑塊，主要位于細胞質，也可位于神經突起(圖1)。五組大鼠海馬CA3區BDNF陽性細胞均數比較有統計學差異(F=102.53，P=0.00)。模型組明顯低于對照組，而經過文拉法辛治療的 PSD大鼠BDNF表達顯著升高，且20 mg·kg-1組促進BDNF表達的能力顯著高于5 mg·kg-1組，差異具有統計學意義(P＜0.05，表5)。

圖1 五組大鼠海馬CA3區BDNF陽性表達Fig.1 BDNF expression in hippocampus CA3 area among five groups

表5 高倍鏡視野下(×400)五組大鼠海馬CA3區BDNF陽性細胞數Table 5 Comparisons of BDNF+cells in CA3 area under high-power field(×400)among five groups

3 討論

近來很多學者致力于抑郁障礙發病機制的研究。如慢性不可預見性溫和應激抑郁模型的發展，海馬腦源性神經營養因子表達的下調與神經再生障礙介導的抑郁行為假說的提出，都使其研究得到了完善和發展。PSD指發生于腦卒中后的抑郁狀態，臨床表現的核心癥狀為情緒低落、興趣減少、快感缺乏和精力減退。PSD作為抑郁障礙的一種特例，由于顯著影響卒中患者生活質量及康復效果，已引起了國內外學者的重視。PSD的發生不僅與腦損傷直接相關，而且與卒中發生時的急性應激及卒中后的一系列慢性應激有關系。大量研究表明，應激在抑郁障礙的發病中起重要作用，由于卒中與應激互為因果并常常伴隨出現，臨床難以將二者截然分開加以研究。隨著卒中后抑郁動物模型建立技術的日益成熟，為深入研究相關的機制奠定了基礎。選擇性右側大腦中動脈栓塞后結合慢性不可預見性溫和應激和孤養已成為廣泛使用的建立卒中后抑郁動物模型的一種方法，該方法建立的抑郁模型能夠較高效地模擬人類的抑郁行為，且抑郁程度可通過糖水偏愛或敞箱試驗衡量［13］。糖水偏愛試驗測試抑郁動物對獎賞刺激的反應性，可反映愉快感缺失這一抑郁的核心癥狀。敞箱試驗反映了抑郁動物精神運動性抑制的特性。由于敞箱試驗的影響因素較多而不易控制，而糖水偏愛試驗操作簡便，影響因素較少，所以更多的學者使用糖水偏愛試驗評價抑郁程度。迄今為止，一線的增強單胺能神經遞質功能的多種抗抑郁藥物均可借助慢性應激模型檢測抑郁動物的糖水攝入量［14］，提示5-羥色胺、去甲腎上腺素等單胺能神經遞質介導抑郁模型的藥理作用。本實驗中模型組大鼠在缺血手術后進行慢性不可預見性溫和應激處理中表現出糖水偏愛程度進行性下降的趨勢，表明大鼠愉快感的下降。在水迷宮試驗中模型組大鼠游泳速度明顯低于對照組，表明了運動活性的下降。這些癥狀證實本研究中使用的抑郁模型是成功的，在給予文拉法辛治療后，PSD大鼠糖水偏愛程度及運動活性均顯著提高，進一步證實該模型是可靠的。

海馬不僅與學習、記憶及情感等高級認知功能密切相關，而且是抑郁障礙多重發病因素的共同交匯點，并介導神經系統結構與功能的可塑性改變。本研究用經典的學習記憶的行為學評價方法，即Morris水迷宮試驗評價PSD大鼠的認知改變，結果證實PSD大鼠學習記憶能力顯著下降。雖然目前對學習記憶的確切機制尚不清楚，但多數學者認為海馬或其鄰近部位如杏仁核損傷所導致的突觸聯系中斷可能是學習與記憶障礙發生的主要原因。Morris水迷宮試驗中大鼠能夠順利找到隱藏的平臺并將平臺所在位置的信息保存下來，有賴于海馬的正常功能。尋找與學習記憶相關的底物一直是醫學科學家感興趣的課題。動物學習過程與信息保持過程與BDNF有一定關系［15］。最近的研究表明，BDNF可促進海馬神經再生，逆轉突觸丟失，穩定基因表達，改善細胞信號轉導，恢復學習與記憶功能［16］。最近發現，慢性不可預見性溫和應激大鼠腦內BDNF表達上調可能是抗抑郁藥發揮治療作用的一種機制，持續的抗抑郁治療幾乎都能使海馬和前額葉皮層BDNF的表達增加［17］;而且BDNF表達異?？赡軐φJ知障礙產生久遠的影響。已有研究［18］表明，接受慢性不可預見性溫和應激的母鼠所生的子鼠海馬BDNF表達下降，其病理生理改變與大鼠在水迷宮試驗中記憶受損相一致。

文拉法辛屬于去甲腎上腺素與5-羥色胺再攝取抑制劑，通過雙受體機制促進海馬BDNF的表達和神經再生而發揮抗抑郁和改善認知的作用。本研究雖然不確定文拉法辛改善認知功能的作用是直接的，還是通過改善抑郁后間接地改善認知缺陷，但有研究發現文拉法辛在促進大鼠額葉皮層及海馬組織BDNF表達的同時，抑制海馬CA1區長時程增強［19］，這說明文拉法辛有可能直接作用于BDNF，從而改善依賴海馬的學習記憶障礙。由于動物實驗已經證實日劑量最低4 mg·kg-1就可引出明顯的行為與藥理學效應［20］;因此，本研究選擇了日劑量分別為 5 mg·kg-1、10 mg·kg-1及 20 mg·kg-1的3個劑量組，觀察不同劑量文拉法辛對PSD大鼠學習記憶的改善作用和海馬CA3區BDNF的表達改變。本研究結果顯示，5 mg·kg-1治療組對學習能力改善作用出現在定速航行試驗的第4天，而10 mg·kg-1治療組及20 mg·kg-1治療組療效出現在第2天，并一直持續到學習測試結束，而且，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1組改善學習障礙的能力顯著高于同時點的5 mg·kg-1組，說明隨著文拉法新劑量增加，改善學習能力的療效更好且起效時間更早。在記憶能力的測試中也出現類似的結果。臨床和基礎的藥動學與藥效學研究均提示文拉法辛在一定范圍內其劑量—效應關系呈線性，但是隨著劑量的進一步升高，除作用于5-羥色胺及去甲腎上腺素遞質外，還可作用于多巴胺能神經遞質，增強上述3種遞質的功能［21］，這一藥理機制決定了其超過某一臨界值以上的非線性劑量—效應關系。我們注意到在空間探索時間比較時，雖然20 mg·kg-1組與10 mg·kg-1組比較無統計學差異，但其改善記憶障礙的能力似乎有下降的趨勢。這一有趣的現象一方面反映出文拉法辛總體非線性的量效關系;另一方面，可能由于20 mg·kg-1組大鼠運動活性最強，運動速度最快，在增加跨平臺次數的同時，在非平臺所在象限的活動范圍增加，導致4個象限的運動時間趨于平均化，反而絕對減少了平臺所在象限的停留時間。

不同組海馬CA3區BDNF免疫組化分析表明，PSD大鼠BDNF表達顯著下降，文拉法辛可促進CA3區BDNF的表達，這與多數學者的研究結果一致。隨著文拉法辛劑量的增加，BDNF的表達也逐漸升高，20 mg·kg-1組免疫組化產物顯著高于5 mg·kg-1組，這一結果與學習記憶能力的變化趨勢一致。相同的變化趨勢表明文拉法辛可能通過BDNF的介導改善PSD大鼠學習記憶障礙，但海馬BDNF表達與認知功能改變是因果關系還是一種并列關系，在本實驗中尚無法定論。最近的一項研究［22］報道，文拉法辛減少強迫游泳大鼠的抑郁行為，但是，慢性不可預見性溫和應激暴露與海馬齒狀回及CA3區mRNA表達升高有關系，作者提出雖然抑郁行為本身與BDNF并不是簡單的一對一的關系，但抗抑郁治療能夠使 BDNF mRNA表達增加。本研究結論與其不一致的原因可能來自:①使用的動物模型不同;②BDNF檢測方法差異;③海馬BDNF表達與抑郁行為之間可能存在復雜的時間空間關系。

本實驗中文拉法辛促進卒中后抑郁大鼠海馬BDNF表達，改善學習記憶障礙，其機制可能與BDNF抑制NMDA對海馬的神經毒作用［23］，抑制神經凋亡促進其再生［24］，以及通過單胺能神經遞質與乙酰膽堿［25］、一氧化氮［26］甚至神經肽［27］等遞質系統的相互作用有關，確切的機制尚待進一步研究。

總之，本研究觀察了不同劑量的文拉法辛對腦缺血合并慢性不可預見性溫和應激模型大鼠的學習記憶障礙的改善作用，結果證實文拉法辛能改善卒中后抑郁癥狀，提高學習記憶能力，其作用可能與增加海馬CA3區BDNF的表達有關。下一步我們將增加樣本量，對卒中后抑郁大鼠腦內BDNF進行預處理，比如通過基因導入或基因敲除的方式，阻斷其表達，觀察文拉法辛對PSD大鼠認知功能的影響。

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