β內(nèi)酰胺抗生素頭孢曲松對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬谷氨酸鹽水平的影響

潘向東，危 靜，肖國(guó)民

(1.浙江省臨安市中醫(yī)院，浙江臨安311300;2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院，浙江杭州310015)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是40～50歲青壯年人群死亡和致殘的第一病因［1］，預(yù)防和治療TBI具有非常重要的臨床意義。近30余年來，對(duì)TBI的病理機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)研究取得了較大成果，但至今仍未獲得突破性進(jìn)展［2］。谷氨酸鹽是廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，維持著正常的神經(jīng)生理活動(dòng)。當(dāng)腦損傷時(shí)谷氨酸鹽過度釋放，激活谷氨酸鹽受體，導(dǎo)致細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，引起鈣介導(dǎo)的細(xì)胞酶活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。興奮性神經(jīng)毒性被認(rèn)為是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理發(fā)展過程中的共同通路［4］。因此，阻斷谷氨酸鹽神經(jīng)毒性是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要策略之一［5］。

谷氨酸鹽由突觸前膜和膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控，谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體可攝取和貯存谷氨酸鹽，維持腦內(nèi)谷氨酸鹽的穩(wěn)定［3，6］。谷氨酸鹽受體拮抗劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)與谷氨酸鹽神經(jīng)毒性有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病無治療效果［7］。因而，增強(qiáng)谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，阻斷和/或調(diào)控谷氨酸鹽神經(jīng)毒性已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的一項(xiàng)重要策略。

近年研究發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺抗生素不僅有抗菌作用，而且能激活谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1的表達(dá)，具有阻斷谷氨酸鹽神經(jīng)毒性作用［8-11］。在缺血性腦中風(fēng)和肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型中，頭孢曲松有神經(jīng)保護(hù)效果［7］;而TBI具有與缺血性中風(fēng)等腦損傷疾病類似的病理過程。因而推測(cè)，頭孢曲松有可能減輕谷氨酸鹽的神經(jīng)毒性。為此，本研究觀察了頭孢曲松對(duì)TBI大鼠谷氨酸鹽水平的影響，以探討頭孢曲松對(duì)TBI的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備 頭孢曲松(ceftriaxone，CTX)為上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H10983036;產(chǎn)品批號(hào):SH1195)。谷氨酸(glutamate，Glu)、天冬氨酸(aspartic acid，Asp)標(biāo)準(zhǔn)品由華美生物工程公司提供。還有WATERS600E高效液相色譜儀和Empower色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD大鼠45只，雄雌不分，體重250～300 g。隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組(Sham 組，9 只)、創(chuàng)傷組(TBI組，18 只)和創(chuàng)傷+CTX干預(yù)組(TBI+CTX組，18只)。每組又隨機(jī)平分成術(shù)后3 h、12 h及24 h 3個(gè)小組。各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦。TBI+CTX組傷后立即腹腔注射CTX 200 mg/kg;Sham和TBI組按同樣方法腹腔注射等容量生理鹽水。

1.3 動(dòng)物模型制作 TBI組和TBI+CTX組采用改良Feeney法制成腦外傷模型，由撞桿、下落鍾、外周套管三部分組成一打擊器。撞桿頭端直徑5 mm、高3 mm、擊鍾重20 g，下落高度30 cm。戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。俯臥固定頭部，矢狀切開頭皮，顯露右頂骨，在人字縫前2 mm，右側(cè)中線旁2 mm用牙鉆鉆一小孔并擴(kuò)大至5 mm×5 mm，撞桿頭端置于右頂骨硬膜外，用擊鍾沿外周套管從30 cm高自由落下沖擊撞桿，造成右頂葉局限性腦損傷，止血后縫合頭皮。Sham組僅切開頭皮，打開骨窗，不致傷。

1.4 大鼠海馬Glu和Asp測(cè)定 傷后12 h取大鼠海馬組織，稱重，加入0.4 mol/L的高氯酸溶液內(nèi)(即每100 mg腦組織加0.4 mol/L的高氯酸1.0 ml)。在冰浴下充分勻漿15 min，冰浴沉淀 30 min，于 4℃、10 000 r/min離心 15 min，取上清液，每1 ml上清液加4%的碳酸氫鈉溶液 0.75 ml，混勻后，于 4℃、3 000 r/min 離心5 min，取上清液，于-75℃保存待用。采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相熒光色譜法［12］檢測(cè)大鼠海馬Glu和Asp含量。

1.5 腦組織含水量測(cè)定 傷后3 h、12 h及24 h分別取腦傷灶后緣約2 mm處腦皮層一塊，約5 mm×5 mm×5 mm大小，電子天平稱濕重后，置于真空恒溫干燥箱，100℃烘烤24 h稱干重。按Elliot等方法計(jì)算腦組織含水量。

1.6 病理形態(tài)學(xué)觀測(cè) 傷后24 h取腦，立即經(jīng)40 g/L中性甲醛固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，在海馬齒狀回互包平面作石蠟切片，片厚5 pm，HE染色。低倍鏡下觀察海馬CAl區(qū)內(nèi)錐體細(xì)胞帶的厚度，高倍鏡下觀察海馬CAl區(qū)存活錐體細(xì)胞情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件11.5，所得數(shù)據(jù)均以±s表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)(3、12和24 h)腦組織含水量比較(F=14.8732，P＜0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，TBI組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均高于Sham組(P＜0.05);TBI+CTX組3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量與Sham組比較差異無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，而與TBI組比較腦組織含水量明顯減輕(P ＜0.05)，見表1。

表1 頭孢曲松對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織含水量的影響Table 1 Effects of ceftriaxone on brain tissue water in rats with traumatic brain injury(±s，%)

表1 頭孢曲松對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織含水量的影響Table 1 Effects of ceftriaxone on brain tissue water in rats with traumatic brain injury(±s，%)

與Sham組比較，*P＜0.05;與TBI組比較，▽P＜0.05.

組 別 n 傷后時(shí)間/h 3 12 24 Sham 9 68.45±5.21 70.65±1.41 69.91±8.25 TBI 18 76.69±6.83* 79.79±1.98* 89.50±5.03*TBI+CTX 18 69.97±4.06▽ 70.41±1.53▽ 70.51±1.36▽

2.2 大鼠海馬Glu和Asp水平 傷后12 h，TBI+CTX組大鼠海馬Glu水平明顯低于TBI組(P＜0.05);TBI組海馬Glu水平顯著高于Sham組(P＜0.05);TBI+CTX組與Sham組比較無顯著性差異(P＞0.05)。傷后12 h，TBI+CTX組大鼠海馬Asp水平明顯低于TBI組 (P＜0.05);TBI組海馬Glu水平顯著高于Sham組 (P＜0.05);與Sham組比較，TBI+CTX組海馬Asp水平無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1、表2。

圖1 創(chuàng)傷+頭孢曲松干預(yù)組大鼠海馬高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of hippocampus glutamate in trauma+ceftriaxone group

表2 頭孢曲松對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬谷氨酸和天冬氨酸的影響Table 2 Effects of ceftriaxone on hippocampus glutamate in rats with traumatic brain injury(μmol·mg-1)

2.3 大鼠海馬病理形態(tài)學(xué) 傷后24 h光鏡下觀察:Sham組可見海馬CAl區(qū)細(xì)胞分布均勻、整齊，僅有少量神經(jīng)元死亡。TBI組海馬CAl區(qū)出現(xiàn)大量神經(jīng)元死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞碎裂、核固縮、溶解。TBI+CTX組海馬CAl區(qū)神經(jīng)元死亡明顯少于TBI組(圖2)。

3 討論

根據(jù)目前對(duì)TBI病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，理論上可以認(rèn)為β-內(nèi)酰胺抗生素同樣有降低TBI后谷氨酸鹽神經(jīng)毒性的作用，對(duì)TBI具有神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到，β-內(nèi)酰胺抗生素CTX可以使TBI大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元死亡明顯減少，可以減輕TBI大鼠腦水腫。提示β-內(nèi)酰胺抗生素CTX可能對(duì)TBI具有神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺抗生素CTX確實(shí)能降低TBI大鼠海馬谷氨酸鹽水平，這可能是CTX對(duì)TBI神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞(HE染色 ×400)Fig.2 Pathology slices of hippocampal CA1 pyramidal neurons(HE ×400)

β-內(nèi)酰胺抗生素是1928年發(fā)明的抗菌素，是目前臨床最廣泛使用的抗菌藥物之一，安全可靠，療效確切，易通過血腦屏障，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒有明顯的毒性作用。目前臨床上主要以抗菌藥物用于預(yù)防和治療TBI患者并發(fā)的感染。如果作為神經(jīng)保護(hù)藥物長(zhǎng)期使用必然會(huì)產(chǎn)生耐藥性和菌群失調(diào)，因此CTX并不適合成為一種神經(jīng)保護(hù)劑。但進(jìn)一步了解CTX神經(jīng)保護(hù)作用分子機(jī)制，有助于研究針對(duì)此靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)藥物。另外，如能證實(shí)CTX對(duì)TBI有神經(jīng)保護(hù)作用，可提醒臨床醫(yī)師在TBI患者治療過程中，如需要選用抗生素，可首先考慮選用β-內(nèi)酰胺抗生素，在抗菌治療的同時(shí)也可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。本次實(shí)驗(yàn)參照Lipski等［10］在腦缺血中風(fēng)動(dòng)物模型CTX的給藥方法和劑量，大鼠致傷后立即一次性給予CTX 200 mg/kg，這種給藥方式主要目的是初步驗(yàn)證CTX對(duì)TBI神經(jīng)保護(hù)效果。β-內(nèi)酰胺抗生素CTX是否對(duì)TBI有神經(jīng)保護(hù)作用，目前尚不能完全證實(shí)，有待今后進(jìn)一步研究。

［1］FINFER S R，COHEN J.Severe traumatic brain injury［J］.Resuscitation，2001，48(1):77-90.

［2］JAIN K K.Neuroprotection in traumatic brain injury［J］.Drug Discovery Today，2008，13(23-24):1082-1089.

［3］SHIGERI Y.Molecular pharmacology of glutamate transporters，EAATs and VGLUTs ［J］.Brain Res Rev，2004，45(3):250-265.

［4］JIANREN M.Glutamate transporter:an unexpected target for some antibiotics［J］.Molecular Pain，2005，1:5.

［5］BESSON V C.Drug targets for traumatic brain injury from poly(ADP-ribose)polymerase pathway modulation ［J］.Br J Pharmacol，2009，157(5):695-704.

［6］BOTTCHER T.Clindamycin is neuroprotective in experimental streptococcus pneumoniae meningitis compared with ceftriaxone［J］.J Neurochem，2004，91(6):1450-1460.

［7］KOLLER M，URWYLER S.Novel N-methyl-D-aspartate receptor antagonists:a review of compounds patented since 2006［J］.Expert Opin Ther Pat，2010，20(12):1683-1702.

［8］ROTHSTEIN J D，PATEL S，REGAN M R，et al.blactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporterexpression ［J］.Nature，2005，433(7021):73-77.

［9］CHU K，LEE S T，SINN D I，et al.Pharmacological induction ofischemic tolerance by glutamate transporter-1(EAAT2)upregulation ［J］.Stroke，2007，38(1):177-182.

［10］LIPSKIJ，WAN C K，BAIJZ，etal.Neuroprotective potential of ceftriaxone in in vitro models of stroke ［J］.Neuroscience，2007，146(2):617-629.

［11］LIU Chunhua，WANG Weizhi(劉春華，王維治).Effect of Cefteriaxone on neurotoxic of glutamic acid and its mechanism［J］.Chin J Nerv Ment Dis(中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志)，2007，33(1):42-45.(in Chinese)

［12］ZHU Ling-ying，KONG Ming，PENG Ying-ru，et al(朱玲英，孔 銘，彭蘊(yùn)茹，等).Study on the determination of glutamic acid and γ-aminobutyric acid in hippocampus of rat by HPLC ［J］.Chin J Modern Applied Pharmacy(中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué))，2009，26(8):654-656.(in Chinese)