ALLOFERON-1抗生肽串聯(lián)重組表達及重組ALLOFERON-1體外抗腫瘤活性

徐小寅，嚴(yán) 杰，孫 琦

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，浙江杭州310058;2.浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，浙江杭州310053)

抗生肽(antibiotic peptide)或稱抗菌肽(antibacterial peptide)是許多生物體內(nèi)基因編碼、特定外界條件誘生的一類具有多種生物學(xué)活性的小分子多肽，具有對熱穩(wěn)定、有廣譜殺菌或殺腫瘤細(xì)胞的作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性等特點［1-2］。Alloferon-1是 Chernysh等(2002 年)從一種麗蠅(Calliphora vicina)血液中分離的新型抗生肽，由13個氨基酸組成，相對分子量為1481.53［3］。研究表明，Alloferon-1 較其它抗菌肽有更為明確的抗病毒和抗腫瘤效果。然而，天然抗生肽表達量較低、提取步驟復(fù)雜、得率不高，而采用化學(xué)合成法合成的抗生肽價格昂貴［1，4］。因此，采用基因工程技術(shù)高效表達Alloferon-1有重要的現(xiàn)實意義［5］。

由于Alloferon-1序列中不含賴氨酸和精氨酸，而且C端序列對其活性無明顯影響，本研究在Alloferon-1序列C端加入胰蛋白酶酶切位點的賴氨酸殘基(Alloferon-1-K)，構(gòu)建了重復(fù)14次的Alloferon-1-K串聯(lián)DNA片段及其原核表達系統(tǒng)，建立了目的重組融合表達產(chǎn)物14×rAlloferon-1-K及其胰蛋白酶消化后rAlloferon-1-K單體提純方法，并采用 CCK8法檢測了rAlloferon-1-K體外抗腫瘤的生物學(xué)活性，以期為rAlloferon-1-K開發(fā)為抗腫瘤新型多肽類藥物提供判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Alloferon-1和Alloferon-1-K合成 根據(jù)Alloferon-1序列［1］，委托上海 Invitrogen公司合成Alloferon-1(cAlloferon-1)及C端加有賴氨酸的Alloferon-1(cAlloferon-1-K)。cAlloferon-1序列:His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly。Alloferon-1-K序列:His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-Lys。

1.2 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K直接抗腫瘤試驗 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種1×104人口腔鱗狀上皮癌KB細(xì)胞、2×104人胃腺癌SGC細(xì)胞，采用10%胎牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)液(GiBco)在5%CO2、37℃培養(yǎng)12 h。96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種懸于2.5%胎牛血清(FCS)RPMI-1640培養(yǎng)液中的1×105人白血病K562細(xì)胞。各細(xì)胞培養(yǎng)物中加入用2.5%FCS RPMI-1640培養(yǎng)液配制的不同濃度cAlloferon-1或cAlloferon-1-K藥物，不同細(xì)胞每種抗生肽濃度均重復(fù)3孔，37℃、5%CO2分別培養(yǎng) 24、48、72 h后，每孔加入CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)中的 CCK-8 試劑 10 μl，在 37℃、5%CO2條件下顯色1 h后測定各孔OD450值，以檢測cAlloferon-1及cAlloferon-1-K對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。

1.3 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K間接抗腫瘤試驗 采集雄性BALB/c小鼠(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心)脾臟細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心獲得的脾細(xì)胞沉淀懸于20%FCS RPMI-1640 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下預(yù)培養(yǎng)12 h。離心收集細(xì)胞，重懸于2.5%FCS RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。在96孔板每孔1×104KB、2×104SGC細(xì)胞中加入脾細(xì)胞懸液，使脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例為10∶1，再加入不同濃度的cAlloferon-1或cAlloferon-1-K，不同細(xì)胞不同藥物濃度均重復(fù)3孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24、48、72 h。吸棄懸浮的脾細(xì)胞，用2.5%FCS RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，按上法加入 CCK-8試劑，顯色并測定 OD450值。按10∶1的比例將脾細(xì)胞與1×105K562細(xì)胞混合，按上法培養(yǎng) 12、18、24 h，每孔直接加入CCK-8，顯色后測定OD450值。腫瘤細(xì)胞殺傷率=［1-(藥物作用后脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞OD450值-藥物未作用脾細(xì)胞OD450值)/藥物未作用腫瘤細(xì)胞OD450值］×100%［6］。實驗中設(shè)置不加cAlloferon-1及cAlloferon-1-K的正常細(xì)胞對照。

1.4 串聯(lián)Alloferon-1-K雙鏈DNA片段的構(gòu)建及克隆和測序 根據(jù)Alloferon-1氨基酸序列并參考大腸桿菌偏愛密碼子，反推設(shè)計并委托上海Invitrogen公司合成了一對單鏈DNA，正鏈為3＇端有賴氨酸密碼子的一個Alloferon-1基因序列，負(fù)鏈DNA與正鏈交錯互補。正鏈序列:5＇-磷 酸 化-CATGGCGTGAGCGGCCATGGCCAG CATGGCGTGCATGGCAAA-3＇，負(fù)鏈序列:5＇-磷酸化-GCCATGGCCGCTCACGCCATGTTTGCCAT GCACGCCATGCTG-3＇。在1×T4 DNA 連接酶緩沖液(TaKaRa)中將225 pmol正鏈與等量負(fù)鏈DNA混合，PCR儀中95℃ 3 min，關(guān)閉電源使反應(yīng)物自然冷卻30 min，55℃ 10 min后加入T4 DNA連接酶(TaKaRa)，16℃連接過夜，以修復(fù)DNA雙鏈中缺口。采用Ex-Taq PCR試劑盒(TaKaRa)將串聯(lián)的Alloferon-1-K雙鏈DNA兩端單鏈補齊并連上 3＇-A，反應(yīng)參數(shù):94℃ 5 min、55℃ 10 min、72℃ 30 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠DNA回收試劑盒(Simgen)回收約1 kb的DNA片段，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將DNA片段與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化入E.coli DH101B中擴增，用質(zhì)粒提取試劑盒(Simgen)提取重組質(zhì)粒，核酸內(nèi)切酶BamH I與HindⅢ(TaKaRa)雙酶切初步鑒定后，委托上海Invitrogen公司測序。

1.5 14×Alloferon-1-K基因擴增及其原核表達系統(tǒng)構(gòu)建 上游引物:5＇-CGC CAT ATG(Nde I)TAC GCC AGC TTG CAT GCC TGC-3＇，下游引物:5＇-CCG CTC GAG(Xho I)TAC CCG GGG ATC CTC TAG AGA-3＇，引物由上海Invitrogen公司合成。根據(jù)測序結(jié)果選取序列正確的14×Alloferon-1-K質(zhì)粒DNA為模板，采用循環(huán)降溫PCR擴增目的片段，反應(yīng)參數(shù):94℃ 5 min;94℃ 30 s、68℃ 30 s、72℃ 1 min，5個循環(huán);94℃ 30 s、66℃ 30 s、72℃ 1 min，5 個循環(huán);94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 1 min，5 個循環(huán);94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 1 min，15 個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按上法將回收的目的片段與pMD19-T連接，形成重組質(zhì)粒 pMD19-T14×Alloferon-1-K。原核表達載體pET42a(Novagen)和pMD19-T14×Alloferon-1-K分別用 Nde I和 Xho I 37℃雙酶切過夜，瓊脂糖凝膠電泳后回收的14×Alloferon-1-K與線性化 pET42a用 T4 DNA連接酶16℃連接16 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli BL21DE3(Novagen)中，形成表達系統(tǒng) E.coli BL21DE3pET42a-14×Alloferon-1-K;然 后，提 取pET42a14×Alloferon-1-K，并委托上海 Invitrogen 公司測序。

1.6 目的重組產(chǎn)物的表達和酶切及提純 E.coli BL21DE3pET42a-14×Alloferon-1-K在含 0.5 mmol/L IPTG(Sigma)LB培養(yǎng)液中，30℃誘導(dǎo)目的重組蛋白 14×rAlloferon-1-K表達，SDS-PAGE與Bio-Rad凝膠圖像系統(tǒng)檢查其表達情況及產(chǎn)量。采用Ni-NTA親和層析柱(BioColor)提純14×rAlloferon-1-K，溶于 pH 8.0、0.01 mol/L 磷酸(PB)緩沖液中，每10 mg 14×rAlloferon-1-K加入0.1 mg胰蛋白酶(Sigma)，37℃酶切2 h后過 Sephadex G-50柱(Pharmacia)，收集含rAlloferon-1-K單體的第三洗脫峰，洗脫液為上述PB，紫外分光光度法測定蛋白濃度。

1.7 rAlloferon-1-K抗腫瘤活性檢測 按上述間接抗腫瘤試驗方法和步驟，96孔培養(yǎng)板每孔1×104KB、2×104SGC、1×105K562細(xì)胞中分別加入1×105、1×105、1×106BALB/c小鼠脾細(xì)胞，然后加入不同濃度 rAlloferon-1-K，在5%CO2和37℃條件下，KB和K562細(xì)胞培養(yǎng)24 h、SGC細(xì)胞培養(yǎng)72 h，加入CCK-8試劑顯色1 h后測定OD450值并計算腫瘤細(xì)胞殺傷率。實驗中同時設(shè)置cAlloferon-1和cAlloferon-1-K陽性對照及不加任何藥物的正常對照。

1.8 數(shù)據(jù)分析 獲得的OD450值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間OD450值先用多組間方差分析后，再采用共同對照t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K的直接抗腫瘤作用 在0.1～1 000 ng/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，cAlloferon-1和cAlloferon-1-K均無抑制KB、SGC和K562腫瘤細(xì)胞生長及增殖的活性(P＞0.05，表1)。

表1 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K直接抗腫瘤效果Table 1 Direct anti-tumor effects of cAlloferon-1 and cAlloferon-1-K

2.2 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K間接抗腫瘤作用 在小鼠脾細(xì)胞存在下，0.1～10 ng/ml cAlloferon-1和cAlloferon-1-K分別作用KB和K562腫瘤細(xì)胞24 h，作用SGC腫瘤細(xì)胞72 h時均顯示了明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長及增殖的活性(P＜0.01)，cAlloferon-1和 cAlloferon-1-K體外抗腫瘤細(xì)胞活性無明顯差異(P＞0.05，表2)。

2.3 14×Alloferon-1-K基因測序結(jié)果 測序結(jié)果顯示，原核重組表達載體pET42a14×Alloferon-1-K中插入了序列完全正確的重復(fù)14次的Alloferon-1及其C端有胰蛋白酶酶切位點賴氨酸(K)密碼子AAA(14×Alloferon-1-K)(圖1)。

2.4 Alloferon-1-K表達和純化結(jié)果 14×rAlloferon-1-K表達量約為細(xì)菌總蛋白的30%(圖2)。胰蛋白酶消化后14×rAlloferon-1-K過Sephadex G-50柱后的第一和第二峰分別是未消化14×rAlloferon-1-K和胰蛋白酶，第三峰是 rAlloferon-1-K 單體(圖3)，濃縮后rAlloferon-1-K蛋白質(zhì)量濃度為1.5 mg/ml。

表2 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K間接抗腫瘤效果Table 2 Indirect anti-tumor effects of cAlloferon-1 and cAlloferon-1-K

圖1 原核重組表達載體pET42a14×Alloferon-1-K測序結(jié)果Fig.1 Sequencing result of prokaryotic recombinant vector pET42a14×Alloferon-1-K

圖2 原核表達及Ni-NTA提純的14×rAlloferon-1-KFig.2 The prokaryotic expressed and Ni-NTA purified 14×rAlloferon-1-K

圖3 胰蛋白酶消化后14×rAlloferon-1-K Sephadex G-50洗脫峰Fig.3 Eluting peaks in Sephadex G-50 column of 14×rAlloferon-1-K after trypsinization

2.6 rAlloferon-1-K間接抗腫瘤作用 在小鼠脾細(xì)胞存在下，0.1～10 ng/ml rAlloferon-1-K分別作用KB和K562腫瘤細(xì)胞24 h、作用SGC腫瘤細(xì)胞72 h時均顯示了明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長及增殖的活性(P＜0.01)，該抗腫瘤活性與cAlloferon-1和cAlloferon-1-K比較均無明顯差異(P＞0.05，表3)。

表3 rAlloferon-1-K間接抗腫瘤效果Table 3 Indirect anti-tumor effects of rAlloferon-1-K

3 討論

抗生肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有抑制或殺傷多種真核、原核細(xì)胞及病毒的小分子多肽，根據(jù)其功能可分為抗細(xì)菌［4，7-8］、抗真菌及原蟲［9］、抗有包膜病毒［3-4，10］、抗腫瘤細(xì)胞［9，11-12］的抗生肽。目前認(rèn)為，多數(shù)具有二級結(jié)構(gòu)的抗生肽作用部位是細(xì)胞膜或病毒包膜，在膜上形成跨膜離子通道，破壞膜的完整性，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而殺死細(xì)胞［4，8，11-12］。另有一些抗生肽的抗病毒或抗腫瘤活性，是通過激活機體免疫系統(tǒng)而實現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)的［3，13］。有文獻報道，Alloferon-1 是具有抗腫瘤及抗病毒活性的新型抗生肽［3，13］，故較其它抗生肽有更為廣闊的應(yīng)用前景和優(yōu)勢。

四甲基氮偶唑鹽(MTT)比色法是檢測細(xì)胞生長與繁殖狀況的常用方法，其底物為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。新近發(fā)展起來的CCK-8法較MTT法有更高的準(zhǔn)確性及檢測靈敏度，其底物WST-8為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，可在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(formazan)，生成的甲臜物量與活細(xì)胞數(shù)量有良好的線性正相關(guān)，而且甲臜無細(xì)胞毒性［14］。KB、SGC和K562細(xì)胞分別是鱗狀上皮癌、人胃腺癌和白血病細(xì)胞，可分別代表3種不同類型的腫瘤細(xì)胞。因此，本研究選用CCK-8法檢測了化學(xué)法直接合成的cAlloferon-1、cAlloferon-1-K及重組表達后提純的rAlloferon-1-K對上述3種不同類型腫瘤細(xì)胞生長及繁殖的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，cAlloferon-1、cAlloferon-1-K和rAlloferon-1-K無直接殺傷KB、SGC和K562細(xì)胞的作用，但具有相似的促進小鼠脾細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞生長及增殖的功能(P＜0.01)，這表明cAlloferon-1-K和rAlloferon-1-K分子C端加上賴氨酸(Lys，K)不影響其抗腫瘤活性。有文獻報道，Alloferon-1抗腫瘤機制主要是刺激細(xì)胞合成干擾素及激活NK細(xì)胞［3，13］。本實驗結(jié)果顯示，cAlloferon-1、cAlloferon-1-K 和 rAlloferon-1-K在0.1～10 ng/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)促小鼠脾細(xì)胞殺傷各腫瘤細(xì)胞的效果與作用濃度無關(guān)，提示各Alloferon-1可能通過激活小鼠脾細(xì)胞而顯示抗腫瘤作用，但對不同腫瘤細(xì)胞最佳抑制作用時間不盡相同:對KB和K562細(xì)胞為24 h，對SGC細(xì)胞為72 h。

各種抗生肽大多來自低等真核細(xì)胞或昆蟲，通常含量極微，若從真核細(xì)胞或昆蟲體內(nèi)提取，不僅工藝復(fù)雜且產(chǎn)量很低，直接化學(xué)合成則成本過高［15-16］。由于抗生肽大多為小分子肽，故采用基因工程技術(shù)構(gòu)建串聯(lián)重組表達系統(tǒng)可有效提高抗生肽產(chǎn)量，大幅度降低成本而有利于產(chǎn)業(yè)化。Chernysh等(2002)從麗蠅血液中分離的另一種抗生肽Alloferon-2，與Alloferon-1極為相似，僅在N端缺少一個組氨酸［3］。然而，Alloferon-2 無抗腫瘤及抗病毒活性［3，13］。因此，我們認(rèn)為N端組氨酸對Alloferon-1生物學(xué)活性至關(guān)重要。由于Alloferon-1氨基酸序列中不含賴氨酸或精氨酸，本研究以賴氨酸密碼子AAA串聯(lián)各個Alloferon-1單體序列進行原核表達，獲得的14×rAlloferon-1-K融合蛋白，經(jīng)胰蛋白酶酶切后獲得14個rAlloferon-1-K單體，從而使rAlloferon-1產(chǎn)量提高了14倍。體外間接抗腫瘤試驗結(jié)果顯示，rAlloferon-1-K與化學(xué)合成的cAlloferon-1及cAlloferon-1-K抗腫瘤生物學(xué)活性相同。在理論上，本研究采用的技術(shù)可獲得更多個串聯(lián)的Alloferon-1-K基因模板，但實際上獲得的Alloferon-1-K串聯(lián)基因長度未超過800 bp，故今后可考慮采用連接引物PCR等方法來獲得更多串聯(lián)數(shù)目的Alloferon-1-K基因模板，從而進一步提高產(chǎn)量。

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