一氧化氮在腦缺血預處理中的作用及其機制

張 超， 季 暉， 趙 倩， 張珍珍

(中國藥科大學藥理學教研室，江蘇 南京 210009)

腦缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)是指腦組織在經過非致死性短暫的重復缺血后，能增強其對缺血的耐受性的一種現象［1］。短暫性腦缺血誘導的腦IPC效應是一種多因素級聯反應，可促進腦內神經元存活，減輕缺血后損傷。一氧化氮(NO)可調節大腦血流量和局部大腦灌注時的新陳代謝活性，對IPC的產生起著至關重要的作用。

1 一氧化氮與一氧化氮合酶

1.1 在腦內的功能

NO由一氧化氮合酶(NOS)產生，NOS具有3種亞型:神經型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)。在健康的大腦中，NO主要由神經元內的nNOS和內皮上的eNOS產生。在神經元中，nNOS主要存在于細胞質中，激活后遷移至細胞膜上，與谷氨酸鹽依賴的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結合并激活受體［2］。NMDA受體被激活后，引起Ca2+內流，激活nNOS產生較低水平的NO［3］。在損傷、缺氧等應激條件刺激下，可誘導膠質細胞產生iNOS，且不依賴Ca2+而持續產生并釋放NO［4-5］。有研究者認為在線粒體中存在著一種新的NOS——線粒體NOS(mtNOS)，但人們對此存在爭議，有人認為所謂mtNOS可能只是線粒體中的nNOS［6］。

NO可介導谷氨酸鹽信號，并對細胞－細胞間的信號傳導產生影響，而谷氨酸鹽信號在長期增強或者減弱的過程中，NO可能發揮一個神經興奮傳遞的反饋傳感器作用，這種反饋對于突觸前/后膜的興奮傳遞和神經網的活性很重要。作為內皮細胞衍生舒張因子，由eNOS和nNOS產生的NO可通過調節局部大腦血流量增加神經元活性。

1.2 在腦缺血后的作用

研究表明，健康腦內的NO濃度是納摩爾水平，然而腦缺血后其濃度升至微摩爾水平，這緣于nNOS的激活。NOS在腦缺血后的作用可被分為兩個方面，即調節血管功能(由eNOS介導)和產生毒性作用(初期由nNOS介導，后期由iNOS介導)。

有研究者曾在nNOS基因敲除小鼠實驗中發現，nNOS基因敲除小鼠在腦缺血后腦內NO水平沒有增加，并對局部缺血和全腦缺血產生耐受。腦缺血誘導nNOS合成的NO對組織的損傷機制包括:致聚ADP-核糖聚合酶(PARP)激活，導致細胞儲存能量耗盡［7］;與超氧化物結合生成亞硝酸鹽;誘導細胞凋亡(Elibol等，Neuroscience，2001 年)。與nNOS基因敲除小鼠實驗的結果一致，nNOS抑制劑也可使動物模型對缺血產生耐受(Yoshida等，J Cereb Blood Flow Metab，1994 年)。

已有研究表明，在腦缺血開始階段，iNOS在腦內并無表達，直到幾天后，膠質細胞和炎癥細胞進入了缺血核心區，方才有表達，而由iNOS產生的NO則可加重組織損傷。Ono等［8］證實小膠質細胞中因iNOS激活所產生并釋放的NO與缺血后延遲性神經元損傷密切相關，且使用iNOS特異性抑制劑或在iNOS基因敲除模型小鼠中進行的實驗也證明，抑制iNOS的表達，可減輕這種損傷(Iadecola等，Neuroscience，1997 年)。

與nNOS和iNOS的毒性作用不同，eNOS在腦缺血后可發揮腦血管保護作用，即舒張血管和抑制血小板聚集及白細胞與內皮細胞黏附。實驗表明，在腦缺血后，eNOS基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其腦內有更大的核心缺血區和更小的半影區，這可能緣于其缺失eNOS的腦血流量調節作用(Huang等，J Cereb Blood Flow Metab，1996年)。

2 腦缺血預處理機制

IPC可出現在不同的組織中，如心臟、大腦、肝、肺和胃腸道片段［9-10］，但是其在各組織中的激活和調控機制是否一樣尚不得而知。IPC的一些保護機制已被證實，如改變細胞基因、上調熱休克蛋白、減少脂過氧化反應、促進炎癥和線粒體新陳代謝等［11-15］，但其分子機制也不十分清楚。

依據短暫性缺血后產生保護效應的時間間隔的不同，腦IPC可分為兩種類型:即時型(early preconditioning)和延遲型(late preconditioning)，即 IPC的保護效應呈“雙峰”時相。前者在短暫性缺血后數分鐘至3 h內即產生保護效應，而后者的保護效應則出現在短暫性缺血后24～72 h，兩者的病理生理及保護機制不同。即時型IPC因為在短暫性缺血后很快產生，僅被認為是翻譯前水平的調控，不像延遲型IPC涉及到基因表達的改變，因此其保護效應產生的時間較短。

對腦IPC的研究起初采用了沙土鼠的全腦缺血模型，結果顯示，阻斷雙側頸總動脈達5 min，即可造成海馬CA1區的神經元損傷，而若在此前預先致腦形成2 min的短暫性缺血，則可減輕隨后缺血造成的CA1區神經元損傷，提示短暫性缺血可對腦組織產生保護效應;但這種保護效應在1～3 d后才出現，說明這是一種延遲型IPC效應。最新研究表明，NMDA受體的激活和相關蛋白的合成是延遲型IPC產生的必要條件［16］。

盡管IPC確切的信號分子尚不明確，但其延遲保護效應的一些激活分子已被人們發現，包括腺苷、緩激肽、細胞因子、NO和活性氧(ROS)。這些分子可以激活IPC的上游信號，其中有些分子與NOS的激活相關，提示NO的產生可能是延遲型IPC效應產生的關鍵。

3 對一氧化氮在腦缺血預處理中作用的研究

3.1 體外模型實驗研究

缺氧－缺糖(OGD)模型可用于對原代神經元或PC12細胞進行的體外模擬腦缺血研究。在神經元細胞培養模型中，短暫的OGD可誘導IPC效應，表現為神經元的抗氧化應激能力增強。然而，細胞培養模型只能用來研究神經元產生IPC的內源性通路［17］，并不能闡明血管的作用和不同組織結構之間的相互作用對IPC產生的影響。

體外實驗顯示，神經元細胞經5～30 min的OGD處理后，對24 h后45～55 min的OGD損傷有保護作用(Grabb等，J Neurosci，1999年)。這種IPC效應與NMDA受體激活、Ca2+內流和新蛋白合成相關，而L-NAME可阻斷此IPC效應，提示NO參與了此IPC效應的產生。使用原代皮層細胞培養模型進行的實驗還發現，NMDA受體興奮后，激活nNOS，導致NO水平升高，繼而激活可抑制Ras相關信號傳導的p21 Ras，產生IPC效應，而使用p21 Ras顯性失活突變體或者p21 Ras抑制劑可以阻斷IPC效應，提示下調Ras相關信號，包括Raf/MEK/ERK通路傳導，可能改變基因表達，并刺激神經元生長和存活相關程序，從而誘導IPC效應(Gonzalez-Zulueta等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 年)。

3.2 體內模型實驗研究

小鼠實驗顯示，連續將大腦中動脈阻斷(MACO)3次(每次持續5 min)，對30 min后永久性腦缺血損傷有保護作用，24 h后的腦梗死體積檢測驗證了這一點(Stagliano等，J Cereb Blood Flow Metab，1999 年)。Atochin等［18］在 eNOS 和 nNOS 基因敲除及野生型小鼠實驗中采用同樣的方法考察了eNOS和nNOS在IPC中的必要性，其間采用多普勒血流儀記錄血流量變化。結果表明，野生型小鼠經過3次MACO后，可使永久性腦缺血24 h后的腦梗死體積減少，但eNOS和nNOS基因敲除小鼠卻未見有此IPC效應。

在新生小鼠缺氧－缺血模型中，IPC效應可以被非特異性NOS抑制劑L-精氨酸(L-NAME)而并非nNOS特異性抑制劑7-硝基吲哚(7-nitroindazole)和iNOS特異性抑制劑氨基胍(aminoguanidine)所拮抗(Gidday 等，J Cereb Blood Flow Metab，1999 年)。Gustavsson等［19］在同一模型試驗中也證實eNOS的基因表達與腦IPC效應相關，即eNOS基因表達的增加可致大腦血管舒張及血流量增加，從而產生IPC效應。

大鼠實驗顯示，給予3 min短暫的MACO或脂多糖(LPS)，可產生腦IPC效應。其中，由LPS誘導的IPC效應被認為與eNOS表達的增加有關，可被非特異性NOS抑制劑L-NAME阻斷，然而，L-NAME卻不能抑制短暫性MACO所致IPC效應(Puisieux等，Eur J Pharmacol，2000年)。這一實驗結果與之前人們的研究結果出現偏差，究其原因，可能是實驗動物種群差異(大鼠 vs小鼠)、模型差異(3 min MACO 1次 vs 5min MACO 3次)和L-NAME不能有效阻斷eNOS表達所致。eNOS誘導腦IPC效應的可能機制是，舒張大腦血管，增加缺血半影區血流量，從而減小腦梗死體積;且與干預白細胞－內皮細胞以及血小板－內皮細胞間相互作用有關(Jiang等，Brain Res，2002 年)。

揮發性麻醉劑也可誘導腦 IPC效應，Wang等［20］認為這和蛋白激酶B(Akt)的激活以及三磷酸腺苷(ATP)依賴性通道等與NO密切相關的信號通路有關。給大鼠腹腔注射異氟烷或者氟烷后24 h，再行2 h MACO，則可產生腦IPC效應，而iNOS抑制劑氨基胍可阻斷此IPC效應，提示iNOS參與了這些麻醉劑誘導IPC效應產生的過程(Kapinya等，Brain Res，2000 年)。Kitano 等［21］在小鼠實驗中發現，使用異氟醚誘導腦IPC效應，存在性別差異，即此誘導方法只對雄性小鼠有效，而對于雌性小鼠無效。這種性別差異來自于Akt的活性差異，繼而改變下游eNOS的活性。

綜上所述，NO在IPC中的作用可分為以下兩個方面:第一，可能通過內源性通路參與IPC效應，發揮觸發器和調控器雙重作用，調節神經元對腦缺血的耐受;第二，作為內皮細胞衍生舒張因子，可在腦缺血后增加灌注血流量，抑制內皮細胞、血小板和白細胞的相互黏連，從而降低腦缺血所致血管功能性損傷。

4 對一氧化氮在腦缺血預處理中作用機制的研究

已有研究表明NO在IPC中的作用機制涉及以下途徑:1)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，NO可激活這兩條通路，并產生級聯反應，如細胞骨架蛋白磷酸化、細胞黏附分子磷酸化以及轉錄因子［如Elk-1、cAMP反應元件結合蛋白(CREB)、NF-κB等］的激活，而轉錄因子的激活又可以導致基因表達的變化，觸發 IPC效應;2)NF-κB通路，NF-κB參與了由細胞因子和生長因子引起的細胞分化、凋亡和生存過程，而短暫性腦缺血誘導產生的NO可激活NF-κB，并誘導產生iNOS，引發IPC效應;3)線粒體K+-ATP通道，一種ATP敏感性的K+通道，被認為可能是延遲型IPC的效應器，而NO可以選擇性激動線粒體K+-ATP通道。

4.1 Ras/Raf/MEK/ERK通路

Ras/Raf/MEK/ERK通路可調節細胞增殖、分化、存活、凋亡的基本過程。研究表明，由nNOS產生的NO可激活G蛋白Ras(Gonzalez-Zulueta等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 年)，使之結合 Ras激酶，并遷移到細胞膜表面;Ras激活絲蘇氨酸激酶Raf，繼而激活MEK激酶家族(MAPK/ERK激酶，MEK1和MEK2)，MEK又致ERK激酶家族(ERK1和ERK2，即p42和p44)磷酸化并激活，而ERK激酶是這個級聯反應的效應分子，不僅可致細胞質中靶蛋白磷酸化，還可致核蛋白和轉錄因子，如CREB和Elk-1磷酸化(見圖1)［16］。此外，體外神經元培養模型實驗發現，ERK的激活與 IPC效應相關(Kolch等，Biochem J，2000年)。筆者所在課題組進行的大鼠實驗也顯示，IPC模型大鼠在腦缺血再灌注后腦內磷酸化ERK(p-ERK)水平升高，而其接受新型NO供體型化合物(S)-ZJM-289治療后，IPC效應增強，且其腦內p-ERK表達水平進一步提高，提示(S)-ZJM-289增強IPC效應的作用可能與ERK蛋白的激活相關。

4.2 PI3K/Akt通路

NO激活的Ras也可通過促進生長因子與酪氨酸激酶受體或者G蛋白偶聯受體結合而激活PI3K/Akt通路［15］。3-磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)被激活后，可水解細胞膜上 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成第2信使 PIP3，而PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)結合，促使PDK致Akt磷酸化并激活(見圖1)。

Akt也稱蛋白激酶B(PKB)，是一種相對分子質量為60000的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有3種亞型，其中 Akt1是與大腦功能密切相關的一種亞型［22］，可在 4 個位點(Ser124、Thr308、Thr450 和Ser473)被PDK磷酸化，且Thr308和Ser473位點的磷酸化可增強Akt1激酶活性。Akt1激活后可致絲氨酸和蘇氨酸磷酸化，繼而影響諸多靶點，如基因轉錄調控蛋白(如 FOCO、IKK、mdm2等)、細胞質酶、組蛋白和細胞程序化死亡相關蛋白(如BAD、Bax、Caspase 9等)。

細胞內鈣濃度的增加可以激活nNOS和eNOS。最近研究表明，eNOS的活性也受磷酸化的蘇氨酸和絲氨酸殘基調控，如因Ser1179位點磷酸化而激活以及因Thr479位點磷酸化而失活［23］。Akt激酶可致eNOS在Ser1179位點磷酸化并激活，是重要的體內eNOS調控因子，其介導的eNOS磷酸化改變了細胞對生長因子如胰島素樣生長因子(IGF-1)的應答。除Akt以外，其他激酶，如PKA、AMPK和PKC也可致 eNOS在不同位點磷酸化，調控其活性。eNOS活性的增加對于IPC的影響機制包括:調節Caspase的表達和磷酸化、PKC通路的激活及基因表達的改變。

總的來說，Akt1及其下游信號分子可促進腦缺血再灌注后神經元的存活，與IPC效應的產生密切相關。

圖1 NO經Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路誘導IPC的分子機制Figure 1 Molecular mechanism of NO-induced IPC via Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways

4.3 NF-κB 通路

在正常狀態下，NF-κB在胞質中與其抑制因子I-κB結合而失去轉錄活性。短暫性腦缺血后產生的適量的NO則能促進PKC致IKK(I-κB的激酶)磷酸化并激活，導致 I-κB磷酸化及降解，使其與NF-κB 解離［24-25］，被釋放的 NF-κB 轉移到細胞核內并誘導目的基因表達 iNOS，激活 CREB［16］，并產生IPC效應(見圖2)。筆者所在課題組研究發現，(S)-ZJM-289用于IPC模型大鼠時，可改善大鼠的神經行為學功能和腦損傷指標。且免疫組化和Western Blot實驗顯示，給IPC模型大鼠使用了(S)-ZJM-289后，大鼠腦內NF-κB和eNOS蛋白表達上調，表明(S)-ZJM-289可通過激活eNOS，釋放NO，促進NF-κB-I-κB解偶聯，致NF-κB 活化并進入細胞核內進行iNOS基因轉錄，從而增強IPC效應。

圖2 NO經NF-κB通路誘導IPC的分子機制Figure 2 Molecular mechanism of NO-induced IPC via NF-κB singal pathway

4.4 線粒體K+-ATP通道

線粒體K+-ATP通道是腦內產生IPC的重要靶點，而PKC的激活被認為是線粒體K+-ATP通道開放的重要環節［26］。已有研究顯示，給IPC模型大鼠在腦缺血前注射K+-ATP通道拮抗劑，可阻斷腦缺血后IPC效應，而K+-ATP通道激動劑在海馬切片中可誘導類似IPC效應［27］;NO則可通過環磷酸鳥苷(cGMP)-PKG-PKC通路選擇性激動線粒體K+-ATP通道［28-29］。最新研究表明，硝酰基和巰基等自由基也可激動該通道［30］。機制研究表明，線粒體K+-ATP通道的開放可抑制細胞膜去極化［31］，增加線粒體呼吸率(Bajgar等，J Biol Chem，2001)，減少ROS產生［32］，抑制胞內鈣的超載，從而抑制神經元凋亡，產生 IPC 效應(Pain等，Circ Res，2000 年)。

5 結語

NO及其代謝物在細胞保護分子信號級聯中起重要作用，可促進IPC效應的產生，對其的深入研究有積極的臨床意義。筆者所在課題組研究表明，新型NO供體型化合物(S)-ZJM-289用于IPC大鼠時，可顯著性降低腦缺血再灌注后的神經元損傷和腦梗死體積，改善神經學功能，其誘導IPC效應的產生與增強eNOS活性和改善線粒體功能相關，它可通過增加eNOS活性，改善內皮細胞功能，增強腦內缺血區域的微循環，促使ERK磷酸化，導致IPC效應的產生。亞硝酸鹽是本課題組最新的研究重點，因為它不僅是一種穩定的NO貯存器，能在缺血后對缺血區域發出類似NO的信號，其具有的氧化還原特性又令它在這個信號通路中的作用具有多樣性，而且它還是IPC效應調節器，在治療腦缺血再灌注損傷方面極具潛在價值。盡管亞硝酸鹽介導IPC效應的機制尚不清楚，但現有的研究數據表明，它是缺血反饋的生理調節器，為治療缺血性疾病的很有潛力的藥物。

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