體外抗體功能修飾抑制性KIR對人NK細胞的影響

吳功強，趙妍敏，黃 河，來曉瑜

(1.浙江大學醫學院附屬第一醫院骨髓移植中心、血液研究所，浙江杭州310003;2.義烏市中心醫院血液科，浙江義烏322000)

異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是目前惡性血液病治愈的唯一有效途徑，但存在移植后移植物抗宿主病(GVHD)、復發和免疫重建等移植相關問題，尤其是如何在防止GVHD的同時誘導足夠強的移植物抗白血病(GVL)作用，是目前臨床移植工作者最大的難題。許多的動物實驗和臨床觀察均提示allo-HSCT后，由于KIR-配體不相合導致供者NK細胞活化，活化的NK細胞具有促進移植物的植入、阻止T細胞介導的GVHD、攻擊宿主白血病細胞發揮GVL效應。因此，如何人工改造或修飾KIR活性，使供者的KIR抑制性受體抑制而激活NK細胞，對改善移植療效具有重要的意義。本研究在建立人NK細胞的體外培養體系的基礎上，研究單克隆抗體封閉抑制性受體KIR2DL1和KIR2DL2/KIR2DL3后對人NK細胞功能的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人慢性粒細胞白血病細胞株K-562細胞和急性早幼粒白血病細胞株NB4細胞均為本實驗室所提供，人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株由浙江大學醫學院附屬第一醫院血液病研究所提供。

1.2 試劑 RPMI 1640培養基和胎牛血清購于GIBCO公司，重組人白介素-2(rhIL-2)及rhIL-15購于Biolegend公司，非放射性細胞毒測定試劑盒購于Promega公司，T淋巴細胞尼龍毛柱為浙江大學免疫所贈送，絲裂霉素購于Sigma公司，TGF-β1因子ELISA檢測試劑盒購自上海朗頓公司，rhGM-CSF、rhIL-4及 LPS均為浙江大學醫學院附屬第一心血管病研究所贈送，KIR2DL1的封閉抗體抗 CD158a單抗及KIR2DL2/KIR2DL3抗體為抗 CD158b單抗購于BD公司，人AB血清購于天津灝洋生物公司，FITC-CD3、PE-CD56購于 Invitrogen公司，X-VIVO 15培養液購于Lonza公司，Rosettesep NK提取試劑盒購自Stem cell公司。

1.3 人NK細胞分選和培養及鑒定 采用Rosettesep NK提取試劑盒分選人NK細胞，在含10%人AB血清的X-VIVO 15培養基中加入分選獲得的NK細胞、200 u/ml的rhIL-2及20 ng/ml的rhIL-15，每隔2～3 d半量換液。將分選所得的NK細胞加入FITC標記的抗CD3和PE標記的CD56抗體，在室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測 CD3-CD56+的細胞比例。同型對照采用分選前的單個核細胞。

1.4 樹突狀細胞(DC)的培養 取新鮮分離的健康成人外周血，收集單個核細胞，然后懸浮于無血清RPMI-1640培養基中，將細胞轉移至6孔培養板，貼壁培養2 h。將上清吸掉，然后用37℃預溫的無血清RPMI-1640培養基洗棄懸浮細胞，共3遍。在貼壁細胞中加入rhGM-CSF(20 ng/ml)、rhIL-4(2 ng/ml)、15% 胎牛血清的完全培養基RPMI 1640，隔天半量換液，第5天收集懸浮細胞作為未成熟DC，加100 ng/ml的LPS繼續培養2 d收集的細胞作為成熟DC。

1.5 抗體修飾對NK細胞殺傷腫瘤細胞及DC的功能實驗 殺傷實驗采用乳酸脫氫酶釋放法(LDH)，具體步驟參照非放射性細胞毒測定試劑盒說明書進行。

1.6 混合淋巴細胞反應(mixed leukocyte reaction MLR) 取健康志愿成人外周血，收集單個核細胞。正常人單個核細胞經絲裂霉素處理作為刺激細胞;取同種異體單個核細胞，經尼龍毛柱純化得到的T淋巴細胞作為反應細胞，刺激細胞與反應細胞比例為1∶5。同時取與反應T細胞同一個體的外周血，采用Rosettesep NK提取試劑盒分選人NK細胞，與混合抗體CD158a+b(0、5、10、20 μg/ml)分別共同孵育60 min;然后，加入到混合淋巴細胞反應體系，與T細胞的比例為1∶5，種入96孔板(用于T淋巴細胞增殖反應的測定)及6孔培養板中(用于測定細胞因子水平);在培養箱中培養72 h后，在6孔培養板收集培養液上清，-80℃凍存備用。用CCK-8方法測定，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.7 ELISA定量測定TGF-β1的蛋白質表達水平 在上述混合淋巴細胞培養3 d后收集上清液，具體按照ELISA試劑盒操作說明書測定。

2 結果

2.1 人NK細胞分離鑒定結果 人NK細胞分選前，外周血單個核細胞中CD3-CD56+細胞比例占10.30%，分選后提高到86.47%(圖1)。

圖1 人NK細胞分選前后的比較Fig.1 Percentage of NK cells before/after isolation

2.2 KIR2DL1抗體修飾對NK細胞殺傷能力的影響 如表1所示，以CD158a單抗封閉KIR2DL1后，NK細胞對NB4細胞的殺傷能力增強(8.38% ±5.23%vs 26.51% ±1.48%)，隨抗體濃度的增加而提高，各組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05);對Raji細胞的殺傷活性提高較小，僅 0 μg/ml組與 20 μg/ml組間比較(3.88% ±1.11%vs 13.01% ±6.56%)，差異有統計學意義(P＜0.05)，而其余各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05);對K-562細胞的殺傷作用，則基本沒有變化(P＞0.05)。效靶比均為10∶1。

表1 單抗封閉KIR2DL1后NK細胞對白血病細胞的殺傷作用Table 1 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL1 blockade(±s，%)

2.3 KIR2DL2/2DL3抗體修飾對NK細胞殺傷能力的影響 如表2示，以抗體CD158b封閉KIR2DL2/2DL3后，NK細胞對NB4細胞的殺傷能力增強(8.72% ±4.27%vs 25.68% ±2.32%)，并隨抗體濃度的增加而提高，各組間差異均有統計學意義(P＜0.05);對Raji細胞的殺傷活性提高較小，僅0 μg/ml組與20 μg/ml組比較(3.05% ±1.67% vs 12.51% ±4.51%)，差異有顯著性(P＜0.05)，而其余各組間比較無統計學差異(P＞0.05)。對K-562細胞的作用，則基本沒有變化(P＞0.05)。效靶比均為 10∶1。

表2 單抗封閉KIR2DL2/2DL3后NK細胞對白血病細胞的殺傷作用Table 2 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL2/2DL3 blockade(±s，%)

2.4 KIR2DL1與KIR2DL2/2DL3抗體聯用對NK細胞殺傷能力的影響 如表3所示，10 μg/ml抗 CD158a單抗及 10 μg/ml CD158b 單抗封閉KIR后，NK細胞對NB4細胞的殺傷能力明顯增強(8.57% ±3.57%vs 23.18% ±3.56%)，2個抗體具有協同作用;而對Raji細胞的作用，雖然兩個抗體聯用殺傷能力有所提高(3.74% ±2.35%vs 10.34% ±5.83%)，但沒有達到統計學意義(P＞0.05);對K-562細胞的作用，則基本沒有變化，無論是單一抗體還是聯用，殺傷活性均無明顯改變(P＞0.05)。效靶比均為10∶1。

2.5 NK細胞對DC的影響 如圖2所示，在效靶比為10∶1的情況下，NK細胞經抗體封閉后，對 DC的殺傷活性明顯提高(2.20% ±1.10%vs 37.59% ±5.06%)，隨封閉抗體濃度的增加而增高，各組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表3 單抗封閉KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3后NK細胞對白血病細胞殺傷作用Table 3 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL1 and KIR2DL2/2DL3 blockade

圖2 NK細胞對DC的殺傷作用Fig.2 Cytotoxicity of NK cell to DC

2.6 混合淋巴細胞反應

2.6.1 T細胞的增殖活性 如圖3所示，抗CD158a與CD158b單抗封閉KIR后，反應細胞的增殖指數降低(77.85% ±8.31%vs 43.05%±5.95%)。各組與0 μg/ml組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。NK細胞與反應細胞比例為1∶5。

圖3 混合淋巴細胞反應Fig.3 Mixed lymphocyte reaction

2.6.2 TGF-β1的表達水平 如圖4所示，抗CD158a與CD158b單抗封閉KIR后，TGF-β1含量有所提高，隨封閉抗體濃度的提高，各組與0μg/ml組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。

圖4 混合淋巴細胞反應中TGF-β1含量Fig.4 The levels of TGF-β1 in mixedlymphocyte reaction

3 討論

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immnoglobulin—like receptor，KIR)主要分布在NK細胞表面，KIR的配體主要為HLA-I類抗原，包括HLA-A、B和C，其中主要為HLA-C類抗原。KIR可分為抑制型和活化型兩大類。由于抑制型KIR與配體的親和性較強，因此在正常情況下，KIR與自身靶細胞的HLA-I類分子相合，抑制NK細胞的活化，從而使自身正常細胞避免自身免疫。而在造血干細胞移植中，當供受者之間存在KIR-配體不相合時，則KIR的信號傳遞活化NK細胞功能，溶解靶細胞，即“丟失自我(missing self)假說。

既往一些臨床研究以及我們在非親緣移植中發現，供受者之間 KIR-配體不相合時產生的活化NK細胞，具有促植入作用、發揮GVL效應以及減輕GVHD的作用。因此，供者NK細胞的活化具有十分重要的地位。在動物實驗中證實，用單克隆抗體封閉抑制性KIR而導致NK細胞活化，具有促進NK細胞的抗腫瘤效應。Tajima等采用 Ly49A阻斷劑可明顯增強Ly49A+NK細胞對表達H-2Dd的腫瘤細胞的殺傷作用。胥昀等研究發現，以抗體修飾抑制性Ly49受體有助于活化NK細胞，提高抗腫瘤能力。但是，至今尚未見體外人KIR功能修飾后NK細胞殺傷活性改變的研究報道。

CD158分子是KIRs家族成員，其主要成員有CD158a和 CD158b。CD158a分子主要為KIR2DL1，CD158b分子主要為 KIR2DL2/KIR2DL3。這些KIR成員通過結合靶細胞的HLA-C位點而抑制NK細胞的殺傷活性，是NK細胞表面重要的抑制性受體。我們認為通過封閉CD158a及CD158b分子可使KIR抑制性受體無法進行抑制性信號的傳遞，從而激活NK細胞的殺傷活性。

本研究作為KIR功能修飾研究的體外部分，以人的NK細胞作為研究對象，研究抗體封閉抑制性受體KIR后，NK細胞殺傷活性的改變。本研究中采用的腫瘤細胞株為K-562、Raji及NB4細胞，其中 K-562細胞表面不表達HLA-ABC 分子;Raji及 NB4 細胞表面表達HLA-ABC分子，而且HLA-C位點均為雜合型。K-562及NB4細胞均為髓系細胞株，而Raji為淋系細胞株。實驗結果提示抗體修飾KIR后，NK細胞對NB4細胞的殺傷活性明顯增強。對Raji細胞影響很小。既往臨床研究以及我們在非親緣造血干細胞移植中表明，在淋系白血病移植中，供受者KIR-配體不相合并不能減少復發風險。而在非淋系白血病患者中卻能明顯減少復發風險，有研究表明，部分淋系白血病細胞表面缺乏或降低表達一些NK細胞表面活化受體的配體，如淋巴細胞表面缺乏黏附分子——白細胞功能相關抗原-1(leukocyte function antigen-1，LFA-1)、MICA/B和或自然殺傷細胞活化性配體UL16結合蛋白(UL16-binding proteins，ULBPs)1-3分子，導致這些淋巴細胞對NK細胞的殺傷作用不敏感。本研究發現，Raji細胞耐受NK細胞的殺傷，是否Raji細胞表面降低或缺乏表達上述的一些分子的表達?我們下一步將檢測Raji細胞及其他淋系細胞表面的分子表達，從而來進一步論證淋系白血病耐受NK細胞的殺傷的機制。人NK細胞對K-562具有很強的殺傷能力(達50%左右)，但抗體修飾KIR后，NK細胞的對K-562殺傷活性并沒有多大改變，這與其表面不表達HLAABC分子有關。

我們發現正常NK細胞對成熟的DC殺傷活性較低，基本處于耐受狀態(NK細胞與DC的KIR-配體相合)，但以抗體封閉KIR抑制性受體后，NK細胞對DC的殺傷活性明顯提高。原因在于成熟的DC表面高表達MHC-I分子，因而活化前NK細胞幾乎不能殺傷成熟的DC，但經抗體封閉KIR后導致KIR-配體不相合，活化NK細胞，從而對DC殺傷活性明顯提高。這說明人為造成KIR-配體不相合所導致的NK細胞的活化主要是通過殺傷成熟DC，從而減少了DC將抗原遞呈給T細胞，也減少了T細胞的活化。

在混合淋巴細胞反應體系中，NK細胞經不同抗體濃度封閉后，T細胞的增殖活性明顯降低。我們檢測反應體系中的TGF-β1表達水平，在經抗體封閉后，該因子的含量明顯提高，可見TGF-β1與T細胞的增殖受抑相關。有研究表明在急性GVHD和急性移植物排斥的發生過程中，除了細胞以外，細胞因子也起重要作用。Tamber 等發現，TGF-β1 基因型高表達者其GVHD發生率較低，對GVHD有保護作用。小鼠的異基因BMT實驗發現，激活的供者NK細胞抑制GVHD的部分原因可能是通過促進 TGF-β1 產生而致。TGF-β1 是一個很強的免疫抑制因子，通過影響淋巴細胞的增殖分化及調節其他細胞因子的產生來發揮其免疫抑制作用。因而，我們可以預測經抗體封閉活化后的NK細胞能通過分泌TGF-β1，進而抑制T細胞的增殖、活化，這可能也是阻止T細胞介導的aGVHD發生的機制之一。

本實驗從體外角度證實了對人NK細胞上的抑制性受體進行抗體修飾后可以增強NK細胞抗腫瘤的能力，并減少T細胞的活化;推測，這可以減少GVHD的發生。下一步我們將開展體內研究，運用小鼠單克隆抗體封閉Ly49受體，在小鼠GVHD模型和白血病骨髓移植模型中研究對NK細胞的活化作用及對骨髓移植后GVHD和GVL的影響，以及KIR單克隆抗體運用于臨床的前期研究。

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