電刺激鼠尾實驗條件的探討

連雪科 肖百全 黃遠(yuǎn)鏗 歐慧瑜 梁惠嬋 楊 威*（廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院，廣東 廣州 510240）

疼痛是多種疾病的癥狀，動物疼痛模型建立對闡明疼痛疾病的發(fā)病機(jī)制以及探討藥物作用原理都具有重要的理論意義和臨床前研究價值。小鼠鼠尾電刺激法是常用的動物疼痛模型，該法具有刺激強(qiáng)度可控，可多次反復(fù)刺激，刺激可立刻產(chǎn)生和終止，極少損傷組織等優(yōu)點。由于該法受到多種實驗因素的影響，實驗結(jié)果可重復(fù)性較差。廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院在鎮(zhèn)痛藥物研究過程中，對相關(guān)實驗條件進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗動物：NIH小鼠，SPF級，18～22g，雄性60只，22～26g，雌性20只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。實驗動物合格證號：0026628，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2003-0002，實驗動物監(jiān)測證號：粵監(jiān)證字2007A004。②試劑：醫(yī)用導(dǎo)電膏，批號：20061116，鑫洋醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。③儀器：TE601-L電子天平，德國賽多利斯公司生產(chǎn)；MP150多導(dǎo)電生理記錄儀，美國BIOPAC公司生產(chǎn)。

1.2 方法

選用檢疫合格的NIH小鼠80只，分成4組：A組20只，雄性，體質(zhì)量18～22g，刺激電壓15V；B組20只，雌性，體質(zhì)量18～22g，刺激電壓15V；C組20只，雄性，體質(zhì)量18～22g，刺激電壓20V；D組20只，雄性，體質(zhì)量22～26g，刺激電壓20V。實驗在下午兩點左右開始，使用MP150多導(dǎo)電生理記錄儀進(jìn)行鼠尾電刺激，參數(shù)設(shè)置為：頻率1Hz，波寬：10ms，波形：連續(xù)A脈沖方波，電壓分為15V和20V兩種。將小鼠固定后，用75%乙醇擦去尾部皮脂，待乙醇揮發(fā)后，尾部涂一薄層導(dǎo)電膠，在小鼠尾部的兩個部位放置電極，進(jìn)行電刺激，記錄每次電刺激發(fā)生嘶叫反應(yīng)的動物數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

兩組之間使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行Fisher確切概率法（雙側(cè)）檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 性別對痛閾的影響

由表1可知，B組發(fā)生嘶叫動物數(shù)顯著高于A組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明不同性別可顯著影響小鼠電刺激致痛的嘶叫反應(yīng)，且雌性小鼠發(fā)生嘶叫反應(yīng)的數(shù)量高于雄性小鼠。

2.2 體質(zhì)量對痛閾的影響

由表1可知，C組動物發(fā)生嘶叫數(shù)略高于D組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明體質(zhì)量對電刺激后發(fā)生嘶叫反應(yīng)的小鼠數(shù)量影響不明顯。

2.3 刺激電壓對痛閾的影響

由表1可知，C組動物發(fā)生嘶叫數(shù)顯著高于A組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明電壓可顯著影響小鼠電刺激致痛的嘶叫反應(yīng)，且電壓越高發(fā)生嘶叫反應(yīng)的數(shù)量越多。

表1 各種實驗條件對電刺激鼠尾后發(fā)生嘶叫反應(yīng)小鼠數(shù)的影響

3 討 論

痛覺是意識水平的感覺，臨床上對有語言能力的患者，要依靠語言來確定其存在和評估其輕重程度，但動物不具備人類這樣的語言能力，因此我們無法確定動物是否具有痛覺，只能觀察其對傷害性刺激的行為反應(yīng)。目前動物疼痛模型主要是軀體疼痛模型，所引起疼痛的方法包括：熱刺激、機(jī)械刺激、電刺激、化學(xué)刺激。由于鼠尾敏感于任何刺激，因此早在1950年Burn[1]就提出了電刺激鼠尾的方法。本法是在小鼠尾部的兩個部位放置電極，進(jìn)行電刺激，以動物產(chǎn)生嘶叫反應(yīng)為指標(biāo)。但是動物疼痛的測量評估受多種因素的影響。

傅英等[2]探討了不同的電壓刺激方式對小鼠足跖電刺激測痛的實驗的影響。本文在電刺激鼠尾致痛實驗中，認(rèn)為需注意以下幾點：①由于小鼠鼠尾本身的電阻抗不一致，因此電極的接觸必須緊密，在接觸部位涂上導(dǎo)電膠為宜，但接觸程度不可過緊，以小鼠不扭頭嘶咬電極為宜。②控制實驗環(huán)境，排除聲、光、溫度、嗅味等轉(zhuǎn)移動物的注意力以及不當(dāng)?shù)牟蹲交蛑苿右饎游锏膽?yīng)激反應(yīng)，從而避免干擾疼痛刺激反應(yīng)的觀測評估[3]。③應(yīng)根據(jù)不同性別的動物施加不同的電刺激強(qiáng)度，一般雄性動物更加能夠耐受電刺激。④電刺激次數(shù)應(yīng)盡量減少，避免產(chǎn)生條件反射。⑤雖然本研究表明動物體質(zhì)量對電刺激鼠尾實驗結(jié)果的影響并不明顯，推測可能是由于動物樣本量有限所致。考慮到不同年齡不同體質(zhì)量的小鼠尾部角化層厚度不同，其阻抗也就不同，建議采用體質(zhì)量盡量一致的動物進(jìn)行實驗。⑥每次實驗盡量在當(dāng)天同一時間進(jìn)行，因小鼠的基礎(chǔ)痛閾呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性，在12：00痛閾最高，24：00痛閾最低[4]。⑦電刺激參數(shù)要根據(jù)使用的具體儀器進(jìn)行設(shè)定。在進(jìn)行電刺激鼠尾實驗時很可能使用的儀器與文獻(xiàn)報道不同，本實驗刺激電壓參數(shù)與文獻(xiàn)報道的10V[5]就不一致，推測是由于本實驗使用儀器的輸出電壓有衰減，因此要根據(jù)儀器情況設(shè)定參數(shù)。

影響動物實驗結(jié)果的因素有很多，包括動物自身因素、飼養(yǎng)環(huán)境因素、營養(yǎng)因素、實驗技術(shù)因素等，因此必須嚴(yán)格控制實驗條件才能獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)性的實驗結(jié)果。本文對電刺激鼠尾實驗的各種因素進(jìn)行了初步探討，希望對實驗人員在進(jìn)行本實驗時有所幫助。

[1] Burn JH,Finney DJ,Goodwin LG.Biological Sandardization[M].Oxford University Press,1950:312-319.

[2] 傅英,戴體俊.小鼠電刺激測痛實驗方法的探討[J].實驗動物科學(xué)與管理,1995,l2(4):33-34.

[3] 楊鎮(zhèn).實驗外科學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版,2004:306-307.

[4] 應(yīng)水旺,黃自強(qiáng).松果體和褪黑激素對小鼠痛覺敏感性的影響[J].中國藥理學(xué)報,1990,11(5):411-414.

[5] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版,1994:379-380.