山楂葉總黃酮對(duì)缺血性腦卒中活血化瘀作用研究*

胡敏 張曉丹 涂映 陳敏 萬(wàn)云輝

（江西護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院 南昌330029）

心腦血管疾病是目前發(fā)病率最高、對(duì)人類健康威脅最為嚴(yán)重的疾病之一。山楂葉總黃酮（flavone mixture of crataegus leaves，F(xiàn)MCL）為花期山楂葉中提取的抗自由基組分，淺棕色至黃色粉末，味澀微苦，含黃酮苷類、葡荊牡黃酮、葒草素、異葒草素、山楂納酰及去乙酰山楂納酰等。已有研究證實(shí)山楂葉總黃酮具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降血壓、強(qiáng)心、降血脂等心血管方面的作用[1]。我們采用血瘀大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察山楂葉總黃酮對(duì)血栓形成、血小板聚集、全血和血漿黏度的影響，探討山楂葉總黃酮通過(guò)改善凝血狀態(tài)發(fā)揮其腦保護(hù)作用的機(jī)理，為其進(jìn)一步深入研究和開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 注射用山楂葉總黃酮（益心酮注射液）批號(hào)：090510，由長(zhǎng)春三九生物制藥提供；舒血寧注射液(銀杏葉提取物注射液)萬(wàn)榮三九藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)090620。

1.2 動(dòng)物 Wistar大鼠，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.3 儀器 CNOOOO5256型6010紫外分光光度計(jì)（安捷倫分析儀器）；GF-D200型半自動(dòng)生化分析儀（山東高密彩虹分析儀器有限公司）；BV-100型血液流變測(cè)試儀，北京泰諾德新技術(shù)研究所；D-37520型超速冷凍離心機(jī)，德國(guó)索孚。

1.4 分組及造模 取60只雄性大鼠，體重280～300 g，按體重隨機(jī)分為六組，每組10只，分別為：空白對(duì)照組、血瘀模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（注射舒血寧注射液0.9 mL/kg）、山楂葉總黃酮高劑量組（60 mg/kg）、山楂葉總黃酮中劑量組（30 mg/kg）、山楂葉總黃酮低劑量組（15 mg/kg）。陽(yáng)性對(duì)照組及山楂葉總黃酮高、中、低劑量組連續(xù)給藥7 d，空白對(duì)照組及模型組腹腔注射等劑量的生理鹽水。于末次給藥30 min后，造血瘀模型。造模方法：皮下注射0.1%腎上腺素0.07 mL/100 g，共兩次，每次間隔4 h，并在此兩次間（前后各2 h）將大鼠浸入冰水中5 min，然后動(dòng)物禁食不禁水[2]?？瞻讓?duì)照組動(dòng)物不造血瘀模型。

1.5 觀察及檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 血瘀大鼠的全血黏度和血漿黏度的測(cè)定造模后次晨，動(dòng)物腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝置血液黏度計(jì)上測(cè)定不同切變率時(shí)的全血黏度。上述抗凝血測(cè)完全血黏度所余血液以2 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)血漿黏度。

1.5.2 血瘀大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間的測(cè)定 麻醉后將大鼠固定于固定臺(tái)上，切開(kāi)頸部皮膚，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈約15 mm，將實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀的刺激電極及溫度傳感器探頭置于動(dòng)脈上，用2 mA的電流刺激血管7 min以損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，隨著動(dòng)脈管腔內(nèi)血栓逐漸形成，血流逐漸被阻斷，動(dòng)脈遠(yuǎn)端溫度逐漸下降，當(dāng)血流完全阻斷時(shí)，溫度突降，儀器報(bào)鳴，此時(shí)儀器顯示時(shí)間即為體內(nèi)血栓形成時(shí)間。

1.5.3 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率的測(cè)定 取50只雄性大鼠，體重200～220 g，隨機(jī)分為五組（每組10只）：空白對(duì)照組（給予生理鹽水），陽(yáng)性對(duì)照組（阿司匹林7.0 mg/kg），山楂葉總黃酮高、中、低劑量組連續(xù)給藥7 d。末次給藥后禁食不禁水12～18 h，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈取血注入放有枸櫞酸鈉溶液的硅化離心管中（枸櫞酸鈉與血比例1:9），將血液與抗凝劑混合后1 000 rpm離心10 min，得富血小板（PRP），然后再3 000 rpm離心15 min，得貧血小板（PPP）。于血小板聚集儀上測(cè)定ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山楂葉總黃酮對(duì)血瘀大鼠全血黏度及血漿黏度的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組全血高、中、低切黏度均明顯增加（P＜0.01或P＜0.001），表明血瘀模型成立。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及山楂葉總黃酮大劑量、中劑量組的全血黏度均有所下降，陽(yáng)性對(duì)照組和山楂葉總黃酮組的血漿黏度也有所下降。見(jiàn)表1。

表1 山楂葉總黃酮對(duì)血瘀大鼠全血黏度與血漿黏度的影響 (±S) mPa·s

表1 山楂葉總黃酮對(duì)血瘀大鼠全血黏度與血漿黏度的影響 (±S) mPa·s

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△P ＜0.001，△△P ＜0.01。

全血黏度組別 n 劑量(mg/kg)血漿黏度9/s 30/s 100/s空白對(duì)照組 10 － 6.03±1.88 4.71±0.66 3.66±0.35 0.85±0.09模型組 10 － 10.16±2.13△ 6.83±1.00△△ 5.15±0.36△△ 1.13±0.14陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.9 mL/kg 7.28±1.48** 5.53±0.45* 4.04±0.22* 1.01±0.21*10 60 8.31±1.59** 5.77±0.52* 4.15±0.43** 1.02±0.12*山楂葉總黃酮組 10 30 8.62±1.00* 5.97±0.7 4.43±0.40 1.09±0.10*10 15 8.79±1.21 6.52±0.34 4.55±0.68 1.10±0.08

2.2 山楂葉總黃酮對(duì)血瘀大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組血栓形成時(shí)間明顯縮短（P＜0.001）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及山楂葉總黃酮大、中劑量組均能明顯延長(zhǎng)體內(nèi)血栓的形成時(shí)間，山楂葉總黃酮小劑量組也能延長(zhǎng)血栓形成時(shí)間，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 山楂葉總黃酮對(duì)血瘀大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間的影響 (±S)

表2 山楂葉總黃酮對(duì)血瘀大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間的影響 (±S)

注：與空白對(duì)照比較，△P＜0.001；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 n 劑量(mg/kg) 體內(nèi)血栓形成時(shí)間（min）空白對(duì)照組 10 － 13.51±2.15模型組 10 － 10.15±1.31△陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.9 mL/kg 12.90±2.31**10 60 12.01±1.34**山楂葉總黃酮組 10 30 11.85±1.66*10 15 11.36±1.50

2.3 山楂葉總黃酮對(duì)大鼠血小板聚集率的影響與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組可以明顯抑制血小板聚集，山楂葉總黃酮大劑量和中劑量對(duì)血小板的聚集也有一定程度的降低。見(jiàn)表3。

表3 山楂葉總黃酮對(duì)大鼠血小板聚集率的影響 (±S)

表3 山楂葉總黃酮對(duì)大鼠血小板聚集率的影響 (±S)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01。

組別 n 劑量(mg/kg) 血小板聚集率（%）空白對(duì)照組 10 － 67.33±11.86陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.9 mL/kg 49.22±15.01**10 60 52.41±7.96*山楂葉總黃酮組 10 30 57.53±9.07*10 15 61.25±9.24

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，缺血性中風(fēng)的發(fā)展演變主要是由于瘀血痹阻腦脈并進(jìn)一步派生出痰飲、風(fēng)熱、瘀毒等病理毒素，從而加劇腦脈病變，閉塞不通從而引發(fā)或加重各種臨床癥狀，甚至成為不可逆的腦缺血損傷[3]。血液流變學(xué)的研究?jī)?nèi)容涵蓋了血栓形成的三種要素：血液成分、血液狀態(tài)和血管壁狀況，因此與缺血性腦血管病有著密切的聯(lián)系。血液流變學(xué)因素與血液的高凝狀態(tài)和腦血流灌注不良有關(guān)，大多數(shù)的腦缺血患者血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)異常。隨著病情的好轉(zhuǎn)，腦缺血患者的血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)也逐漸好轉(zhuǎn)。在血液流變學(xué)中，全血黏度是反映血液流變性的一個(gè)重要指標(biāo)，患者腦缺血后全血黏度和血漿黏度皆升高，尤其全血黏度低切升高更為顯著[4～5]。說(shuō)明全血黏度對(duì)臨床診斷缺血性腦血管病及判斷其嚴(yán)重程度具有重要意義。腦缺血時(shí)，由于腦組織的缺血缺氧，造成腦內(nèi)能量物質(zhì)的缺乏，細(xì)胞膜的流動(dòng)性下降，膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，紅細(xì)胞變形性下降，在毛細(xì)血管內(nèi)的流動(dòng)性降低，血流速度減慢，紅細(xì)胞聚集，最終導(dǎo)致血黏度上升，血流淤滯，引起一系列病理變化。除了紅細(xì)胞的作用外，血小板的粘附和聚集增強(qiáng)也可造成血黏度的上升。有研究顯示[6]血小板功能變化是腦梗死發(fā)病的因素之一，還是造成腦梗死之后缺血性加重的主要原因之一。Uchiyama[7]報(bào)道腦梗死、一過(guò)性腦缺血患者不僅血小板粘附性、聚集性增加，而且參與粘附反應(yīng)的凝血因子增多，因此認(rèn)為血小板的高反應(yīng)性（粘附、聚集、釋放增強(qiáng)）與缺血性腦血管病的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山楂葉總黃酮高、中劑量對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有一定的抑制作用，表明山楂葉總黃酮有降低血小板聚集、抗血栓形成的作用。綜上所述，山楂葉總黃酮對(duì)缺血性腦卒中具有保護(hù)作用，其機(jī)制是通過(guò)降低血黏度、抑制血小板聚集實(shí)現(xiàn)的。

[1]董英杰,張乃先,張明壘.大果山楂葉黃酮成分研究[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,13(1):31

[2]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第 3 版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.1 042

[3]胡國(guó)恒,祝美珍.活血化瘀法防治腦缺血損傷的理論探討[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(6):514-515

[4]王援朝,徐貴燕,戴惠婷,等.耳針治療大鼠實(shí)驗(yàn)性缺血性中風(fēng)癥的研究[J].中國(guó)針灸,2001,21(4):235-236

[5]王健,胡健鵬.缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證動(dòng)物模型的初步研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1999,18(2):46-48

[6]張新江,周大柱.血小板形態(tài)變化與腦梗死[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·腦血管疾病分冊(cè),1997,5(4):197

[7]Uchiyama S,Takeuchi M,Osawsa M,et al.Platelet function tests in thromboic cerebrovascular disorders[J].Stroke,1983,14(4):511-517