藻藍蛋白對2型糖尿病大鼠血糖的調節作用

李繼發 王世金 郭恒照 (濟寧市任城區兗礦集團第三醫院，山東 濟寧 707)

2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，細胞因子是導致代謝綜合征的主要原因，而炎癥是胰島素抵抗的觸發因素〔1〕。甚至在亞臨床階段，慢性炎癥就參與了胰島素抵抗綜合征的發生〔2〕。在整個炎癥網絡中，核因子 κB(NF-κB)是研究的熱點之一。NF-κB抑制蛋白(I-κB)激酶/NF-κB炎癥通路活化是導致胰島素抵抗和糖尿病的重要機制之一〔3〕。張冬梅等〔4〕研究表明，藻藍蛋白在腦缺血損傷中具有抗炎和神經保護作用，但其在2型糖尿病病理生理過程中是否具有抗炎作用尚未見報道。為此，本實驗建立2型糖尿病大鼠，試圖應用藻藍蛋白進行干預，研究其對胰島細胞功能的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型 健康雄性Wistar大鼠30只，體重120～140 g，由青島市藥檢所實驗動物中心提供〔SCXK(魯)20030010〕。動物均于實驗前置于實驗室適應環境1 w，自由飲食，室溫(23±2)℃，自然光照，相對濕度50% ～70%。隨機分為對照組、模型組和治療組各10只。對照組10只大鼠喂以普通飼料，其余2組均喂以高糖高脂飼料(15%豬油、20%蔗糖、13%蛋黃粉、2%膽酸鈉、59%普通飼料)，飼養4 w后禁食12 h，以30 mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液，對照組大鼠同步注射同劑量的檸檬酸緩沖液。注射4 w后分別剪尾取血，測空腹血糖(FBG)，以血糖值≥7.0 mmol/L視為糖尿病模型建立成功〔5〕，其中16只造模成功。

1.2 干預措施 糖尿病模型成功后開始干預治療。藻藍蛋白粉劑(中國科學院海洋研究所提供)暗室分裝后－20℃保存，加蒸餾水稀釋至濃度為10%的混懸液，按500 mg/kg體重灌胃，每天1次，連續10 d。對照組和病模型組同步給予等體積的生理鹽水，連續灌胃10 d。

1.3 FBG測定 各組動物分別在造模前、造模后、治療后測定FBG(mmol/L)。測前，大鼠禁食、禁水12 h，次日鼠尾靜脈取血，用自動血糖儀(強生醫療器材有限公司，穩豪型)測定FBG。

1.4 標本采集及處理 治療結束后，各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注固定，取胰腺組織，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA2135石蠟切片機連續切片，厚度5 μm，每隔10片取1片，每個標本取6片，分別裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存備用。

1.5 細胞凋亡檢測 TUNEL試劑盒由武漢博士德生物公司提供。取上述切片置于60℃烤箱1 h，常規脫蠟，蒸餾水浸泡2 min，按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下細胞核出現片狀棕黃色顆粒者為陽性著色，即凋亡細胞。部分切片不加探針，以0.1 mol/L PBS替代染色，不出現陽性著色。在光鏡(400倍)下觀察，每張切片隨機選取4個視野，計數每個視野100個胰島細胞中凋亡細胞所占的百分比的均數即為凋亡指數(AI)。

1.6 免疫組化染色 NF-κB p65和I-κB親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，均由武漢博士德生物公司提供。取上述切片置于60℃烤箱烤片1 h，常規脫蠟，蒸餾水浸泡2 min，嚴格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下特異性染色為棕黃色粗顆粒。部分切片不加一抗以0.1 mol/L PBS替代染色，不出現陽性著色。在光鏡(400倍)下觀察，每張切片隨即選擇4個視野，計數每個視野內胰島細胞團中NF-κB和I-κB的陽性細胞數及胰島細胞的總數。

1.7 統計學處理 采用SPSS11.5軟件，計量資料結果以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 FBG 造模前各組大鼠FBG無統計學差異，造模后大鼠FBG較對照組明顯升高(P＜0.05)。經藻藍蛋白治療后，大鼠FBG較模型組顯著下降(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FBG比較(，mmol/L)

表1 各組大鼠FBG比較(，mmol/L)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

造模前 造模后 治療后對照組組別 n 10 3.28±0.43 3.48±0.50 3.91±0.71模型組 8 3.33±0.23 9.15±1.201) 8.94±0.901)治療組 8 3.15±0.31 9.75±1.251) 7.05±0.871)2)

2.2 胰島細胞凋亡 對照組大鼠胰島可見少量散在的凋亡陽性細胞，模型組大鼠胰島邊界模糊，陽性細胞較對照組明顯增多(P＜0.05)，治療組大鼠胰島邊界較清晰，凋亡陽性細胞較模型組顯著減少(P＜0.05)。見表2和圖1。

表2 各組大鼠胰島細胞AI、NF-κB和I-κB表達的比較()

表2 各組大鼠胰島細胞AI、NF-κB和I-κB表達的比較()

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n AI(%) NF-κB(%) I-κB(%)10 6.00±1.63 15.7±1.83 78.5±2.55模型組 8 20.75±2.501) 38.3±3.811) 31.2±4.801)治療組 8 12.25±2.221)2) 20.6±3.201)2) 58.0±5.261)2)對照組

2.3 NF-κB和I-κB表達 對照組大鼠胰島細胞質NF-κB表達較強，顯棕黃色。糖尿病模型組大鼠胰島細胞核NF-κB表達顯著增強，細胞核呈明顯棕黃色著色，細胞質幾乎不著色。藻藍蛋白治療組大鼠胰島細胞核NF-κB表達較模型組明顯降低，細胞核呈淡黃色(圖2和表2)。對照組大鼠胰島細胞質呈深棕黃色著色，細胞核幾乎不著色。糖尿病模型組大鼠胰島細胞核、質表達明顯減弱。藻藍蛋白治療組大鼠胰島細胞質有棕黃色著色，較糖尿病組加深(圖3和表2)。

圖1 各組大鼠胰島凋亡細胞數量比較(TUNEL，×400)

圖2 各組大鼠胰島細胞NF-κB的表達(SABC，×400)

圖3 各組大鼠胰島細胞I-κB的表達(SABC，×400)

3 討論

研究表明，大鼠胰腺是STZ毒性損傷的靶器官，STZ可以通過一氧化氮和自由基等途徑損傷胰島β細胞誘發糖尿病〔6〕，而自由基是激活NF-κB的因素之一。由此推測，糖尿病大鼠胰腺中有I-κB/NF-κB通路的活化。本實驗NF-κB免疫組化結果可見，正常組大鼠胰島細胞團中胰島細胞質呈明顯棕黃色著色，只局部胰島細胞核有著色，而糖尿病大鼠胰島細胞團中胰島細胞核呈明顯棕黃色著色，細胞質幾乎不著色。I-κB免疫組化結果顯示，正常組大鼠胰島細胞質呈深棕黃色著色，細胞核幾乎不著色，而糖尿病組大鼠胰島細胞核、質幾乎都不著色。這正體現了I-κB被降解后，激活的NF-κB從細胞質到細胞核的轉移過程。藻藍蛋白干預組大鼠NF-κB的免疫組化結果可見，胰島細胞核著淡棕黃色，著色程度較糖尿病組明顯減輕。I-κB的免疫組化結果顯示，藍藻蛋白干預組大鼠胰島細胞質有棕黃色著色，著色程度較糖尿病組加深。表明藥物干預后I-κB的活性可能有所恢復，NF-κB在胰島細胞核中的表達降低。這提示藻藍蛋白可能具有抑制I-κB/NF-κB通路活化的作用。

長期高血糖使胰島素需求不斷增加，β細胞處于持續活化狀態，一方面削弱胰島β細胞合成和分泌胰島素的功能，使葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，甚至缺失;另一方面，長期高血糖加速β細胞凋亡，使有功能的β細胞數量減少，兩者共同作用加重了胰島β細胞功能的衰竭。導致β細胞凋亡的因素很多，例如胰淀素、葡萄糖、游離脂肪酸、細胞因子、一氧化氮、活性氧簇等〔7〕。沙鼠實驗發現隨著血糖的增高，β細胞的凋亡頻率逐步上升〔8〕。本實驗結果顯示，造模成功后，大鼠 FBG顯著升高，胰島凋亡細胞是明顯增多，經藻藍蛋白治療后，大鼠FBG較模型組顯著下降、胰島細胞凋亡數量明顯減少。推測藻藍蛋白可能作用于胰島β細胞，保護胰島β細胞，減少其凋亡，但其具體機制有待進一步研究。

1 Dandona P，Aljada A，Bandyopadhyay A.Inflammation:the link between insulin resistance，obesity and diabetes〔J〕.Trends Immunol，2004;25(1):4-7.

2 Festa A，D'Agostino R Jr，Howard G，et al.Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome:the Insulin Resistance Atherosclerosis Study(IRAS)〔J〕.Circulation，2002;102(1):42-7.

3 Blaak EE.Fatty acid metabolism in obesity and type 2 diabetes mellitus〔J〕.Proc Nutr Soc，2003;62(6):753-60.

4 張冬梅，劉吉東，陳紅兵，等.藻藍蛋白對腦缺血再灌注后NF-κB和IL-6表達及神經細胞凋亡的影響〔J〕.中國海洋藥物，2005;24(1):6-10.

5 郭嘯華，志 紅，李 恒，等.高糖高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠模型及其腎病特點〔J〕.中國糖尿病雜志，2002;10(2):290-2.

6 Takasa N，Komiya I，Asawa T，et al.Streptozotocin and alloxan-induced H2O2generation and DNA fragmentation in pancreatic islets.H2O2as mediator for DNA fragmentation〔J〕.Diabetes，1991;40:1141-5.

7 Mandrup-Poulsen T.Apoptotic signal transduction pathways in diabetes〔J〕.Biochem Pharmacol，2003;66:1433-9.

8 Donath MY，Gross DJ，Cerasi E，et al.Hyperglycemia-induced beta-cell apoptosis in pancreatic islets of Psammomys obesus during development of diabetes〔J〕.Diabetes，1999;48:738-46.