三氯化鑭對CBRH-7919細胞CDK4和P21蛋白表達的影響

楊立明 姜文平 姜文華 (吉林大學第一醫院腎內科，吉林 長春 300)

肝癌是世界上最常見的腫瘤之一，死亡率居第三，并且其發病率還在逐年上升〔1〕。目前雖然治療方法很多，但效果都不理想，臨床效果差，死亡率高〔2〕。國內外近年的研究表明稀土化合物具有明顯的抑瘤性能〔3～5〕。但有關稀土化合物對肝癌細胞周期影響的研究報道非常少見。本實驗以稀土化合物在體內外均有明顯的抑瘤性能為理論基礎，以大鼠肝癌細胞株CBRH-7919為研究對象，探討稀土化合物三氯化鑭(LaCl3)是否能阻抑CBRH-7919細胞的異常調控，從而阻止腫瘤的進一步發展，阻止腫瘤的浸潤和轉移。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 LaCl3由北京稀土農用中心提供;DMEM培養基、小牛血清、胰酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)均為Gibco公司產品;RNA酶、碘化丙啶(PI)為Sigma公司產品;細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)和P21免疫細胞化學試劑盒為Santa Cruz公司產品，其余試劑為國產分析純。

1.1.2 細胞株 大鼠肝癌細胞株CBRH-7919，購于中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 分組 實驗分為3組;對照組:CBRH-7919培養在含10%小牛血清的DMEM培養液中;實驗組分為兩組:CBRH-7919細胞分別培養在含0.10和1.00 mmol/L LaCl3的DMEM培養液中。培養時間分別為1、3、5 d。

1.2.2 流式細胞術(FCM) 每組收集細胞5×106個，固定于70%冷乙醇中，4℃過夜。加入0.01%RNA 酶 10 ～15 μl，37℃水浴30 min，加0.25%PI染色劑(避光)染色30 min，作流式細胞儀檢測。每組隨機檢測1×105個細胞，計算各期細胞比例。

1.2.3 MTT實驗 CBRH-7919細胞，培養在96孔培養板中(每孔含3×103個細胞)12 h后，分別加入含不同劑量的LaCl3的DMEM培養液。分別培養1、3、5 d。在上述各時間點作用結束前4 h每孔加 MTT(5 g/L)20 μl。培養結束后，每孔加入DMSO 溶液 100 μl，作用 10 min，用酶標儀(波長 570 nm)測定各孔吸光度值(OD值)。

1.2.4 集落形成實驗 取對數生長期的CBRH-7919細胞，每瓶100個細胞，培養12 h后，加入前述濃度的LaCl3，每組設6瓶，連續培養9 d。常規固定、蘇木精染色后，在顯微鏡下計數多于50個細胞的克隆數。

1.2.5 免疫細胞化學方法 CDK4和P21均采用親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)法，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。在顯微鏡下觀察并計數1 000個細胞中的陽性細胞數，并計算其陽性率。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，以確定免疫細胞化學染色的特異性。

1.3 統計學分析 應用SPSS10.0統計軟件，OD值、集落形成數量，采用單因素方差分析;G0/G1期、S期比率及CDK4和P21蛋白表達的陽性率進行組間的χ2檢驗。

2 結果

2.1 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞生長及集落形成的影響 MTT實驗結果表明，0.10 mmol/L LaCl3作用3 d即對CBRH-7919細胞生長具有明顯的抑制作用;隨著LaCl3劑量的增加和作用時間的延長，對CBRH-7919細胞生長的抑制作用也增強。集落形成實驗顯微鏡下觀察可見，對照組集落滿視野，體積大;0.1 mmol/L LaCl3組集落分布稀疏，體積較小;1 mmol/L LaCl3組集落偶見，體積小。0.1、1 mmol/L LaCl3對CBRH-7919細胞的集落形成具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性。見表1。

2.2 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞G0/G1期及S期的影響 流式細胞儀結果可見，CBRH-7919細胞經0.1、1 mmol/L LaCl3作用1、3、5 d后，G0/G1期細胞百分數增加，S期細胞百分數減少，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

2.3 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞CDK4和P21表達的影響 CDK4免疫細胞化學實驗結果表明，隨著LaCl3劑量與時間的增加，陽性細胞數逐漸減少，著色強度也越來越弱;0.10 mmol/L 和 1.00 mmol/L LaCl3組1、3、5 d CDK4 表達均明顯減弱，與對照組相比有非常顯著差異(P＜0.01);1.00 mmol/L LaCl35 d組CDK4表達最弱。P21免疫細胞化學實驗結果表明，對照組陽性細胞數很少，分布稀疏，染色淡;0.10 mmol/L LaCl3組細胞在培養1、3、5 d后，P21陽性細胞數有所增加，但與對照組比較無顯著性差異;而1.00 mmol/L LaCl3組細胞在培養1 d后P21陽性率即呈顯著性增加，而且隨著培養時間的延長，增加的程度越高。見表3。

表1 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞生長及集落形成的影響(n=6，±s)

表1 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞生長及集落形成的影響(n=6，±s)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與同組1 d、3 d比較:3)P ＜0.01;下表同

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表2 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞G0/G1期及S期比率的影響(n=6，± s，%)

表2 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞G0/G1期及S期比率的影響(n=6，± s，%)

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表3 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞CDK4和P21表達陽性率的影響(n=6，± s，%)

表3 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細胞CDK4和P21表達陽性率的影響(n=6，± s，%)

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3 討論

眾多的研究表明細胞周期調節的失控與腫瘤的發生﹑發展具有密切的關系。在細胞周期調控中G1/S的調節尤為重要。細胞一旦從G1期跨入S期，則不再依靠外來信息刺激而自動完成分裂過程。CDK4是細胞周期G1期重要的調控分子，CDK4蛋白能夠特異性地與細胞周期素(Cyclin D1)結合形成復合物，使視網膜母細胞瘤(Rb)蛋白磷酸化，導致轉錄因子(E2F)的釋放，促使細胞完成DNA復制;P21是CDKs家族廣譜抑制劑，通過抑制CDK活性，誘導周期阻滯導致細胞分裂增殖停止，從而抑制腫瘤細胞生長，為腫瘤抑制基因〔6～8〕。

稀土化合物對腫瘤相關基因表達的研究較少見，劉玉榮等〔9〕研究表明，0.10、0.50 及1.00 mmol/L LaCl3使 SMMC-7721細胞Cyclin D1、增殖細胞核抗原(PCNA)和CDK4蛋白表達下降，P16蛋白表達上升。在本實驗中，0.10及1.00 mmol/L LaCl3對CBRH-7919細胞的生長和集落形成有明顯抑制作用 。通過流式細胞儀檢測細胞周期各時相變化情況，結果顯示0.10、1.00 mmol/L LaCl3均可使G0/G1期細胞百分數顯著增加，而S期細胞百分數顯著下降，表明CBRH-7919細胞從G1期進入S期受阻，使CBRH-7919停留在G1期。表明LaCl3可通過下調 G1期的 CDK4，重建了 CBRH-7919細胞周期失控的G1→S期檢查點，使CBRH-7919細胞從G1期進入S期的過程受阻;而且，LaCl3可刺激 P21的表達，P21表達的增加使CBRH-7919細胞G1→S期的負調控路徑恢復，從而使CBRH-7919停留在G1期，流式細胞術的結果也證實了這一點。

綜上所述，LaCl3可通過下調CDK4和上調P21的蛋白表達，使CBRH-7919細胞阻滯在G1期，從而抑制CBRH-7919細胞的生長。

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5 Chen Y，Yang L，Feng C，et al.Nano neodymium oxide induces massive vacuolization and autophagic cell death in non-small cell lung cancer NCIH460 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;337(1):52-60.

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8 Yu Q，Sicinska E，Geng Y，et al.Requirement for CDK4 kinase function in breast cancer〔J〕.Cancer Cell，2006;9(1):23-32.

9 劉玉榮，陳 東，姜文華，等.三氯化鑭對體外培養人肝癌細胞的抑制作用〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2006;32(6):1029-33.