復(fù)方田七益智顆粒對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬AChE活性的影響

杜正彩 鄧家剛 蘭太進 蘆曉燕 黎劍虹 (廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001)

老年性癡呆系指發(fā)生在老年期的各種癡呆綜合征，包括早老性癡呆(又稱阿爾茨海默病，AD)、血管性癡呆(VD)、混合性癡呆(AD+VD)及其他癡呆。前兩種為老年性癡呆的主要類型，占所有癡呆的90%以上，其典型癥狀均為學(xué)習(xí)記憶功能受到不同程度的損害〔1〕。復(fù)方田七益智顆粒(CTG)是廣西中醫(yī)學(xué)院鄧家剛教授在總結(jié)前賢治療老年性癡呆的基礎(chǔ)上，根據(jù)文獻研究與市場調(diào)查〔2〕，按中醫(yī)藥理論與臨床經(jīng)驗，并結(jié)合藥理研究成果科學(xué)設(shè)計而成。該方具有益氣活血、延壽益智的功效，能顯著改善老年癡呆患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙的癥狀?，F(xiàn)將CTG對癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響報道如下，為CTG的進一步研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，SPF級，長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物中心，No.002805。

1.1.2 實驗藥物 CTG(10 g/袋)，廣西中醫(yī)學(xué)院瑞康醫(yī)院制劑室中心，批號20080506;鹽酸多奈哌齊片，陜西方舟制藥有限公司，批號20080601。

1.1.3 主要儀器 ZH-鼠兔立體定位儀，安徽正華教學(xué)實驗器械廠;Morris水迷宮實驗系統(tǒng)，北京現(xiàn)代太極電子有限公司;ELX-800型酶標儀，美國BIO-Tek;TGL-16M低溫超速離心機，湖南塞特湘儀有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;JY92-2D超聲組織破碎儀，寧波新芝科器研究所;XH-C漩渦混勻器，金壇市醫(yī)療儀器廠;SZ2-1LST解剖顯微鏡，OLYMPUS CORPORTION。

1.1.4 主要試劑 AChE試劑盒，南京建成，批號20080608;考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，南京建成，批號20080308;Aβ25～35，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號08-06-01;水合氯醛，成都市科龍化工試劑廠，批號20071226;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 先用Morris水迷宮篩選大鼠，淘汰學(xué)習(xí)成績過高(5 s內(nèi)找到平臺者)和過低者(120 s內(nèi)未找到平臺者)，訓(xùn)練至成績穩(wěn)定后(連續(xù)2 d成績無顯著性差異)，將篩選出的78只大鼠隨機分為6組:假手術(shù)(NS)組，模型組，陽性藥組(鹽酸多奈哌齊 3 mg·kg－1·d－1)，CTG 高劑量組(14 g·kg－1·d－1)、中劑量組(7 g·kg－1·d－1)、低劑量組(3.5 g·kg－1·d－1)，每組13只。動物造模后第二天，灌胃給藥治療，每天給藥一次，連續(xù)給藥14 d，給藥容積為2 ml/100 g體重，其中假手術(shù)組和模型組給予等體積純凈水。在實驗期間(造模后16 d內(nèi))各組動物死亡例數(shù):假手術(shù)1只，模型組3只，CTG低劑量組2只，CTG中劑量組3只。

1.2.2 造模方法 將2 mg Aβ25～35肽段溶于400 μl滅菌蒸餾水中，濃度為5 μg/μl，封口膜封好后，置 37℃孵72 h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ。大鼠經(jīng)10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，固定于小動物立體定位儀上。手術(shù)器械均需消毒，常規(guī)皮膚消毒，無菌操作。參照包新明等的《大鼠腦立體定向圖譜》，選擇右側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)。用特制三棱針手動鉆顱骨至一定深度，再用微量進樣器旋轉(zhuǎn)鉆動至微有落空感，隨后自頭皮表面垂直進針4.0 mm(微量進樣器鋼針外套一次性輸液器前端細管并固定，針尖留出4.0 mm)，將 Aβ25～35肽段2 μl(10 μg)緩慢(5 min 內(nèi))注入，留針5 min以保證溶液充分彌散，假手術(shù)對照組海馬注射等體積的生理鹽水。然后緩慢撤針(3 min內(nèi)拔出)，傷口消毒后涂紅霉素軟膏，常規(guī)飼養(yǎng)。所有動物手術(shù)前3 d和手術(shù)后10 d腹腔注射青霉素鈉2萬U/只，每天2次。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶能力測定 采用Morris水迷宮測試儀，測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。于造模后14 d起進行測試。Morris水迷宮由圓形水池和自動錄像分析系統(tǒng)兩部分組成。圓形水池由不銹鋼制成，直徑120 cm，高38 cm，池壁為黑色，水深30 cm，水溫保持在(22±1)℃。水池被等份為4個象限，分別稱SW、NW、SE、NE象限。在NW象限正中放置一圓柱形透明有機玻璃站臺，站臺高29 cm，直徑10 cm，平臺低于水面1.2 cm。水池上方的攝像機同步記錄大鼠的運動軌跡(黑水白物)。經(jīng)軟件的分析處理，得到實驗數(shù)據(jù)。整個實驗程序均參照鐘振國等〔3〕的實驗方法進行。待行為學(xué)測試結(jié)束之后，脫臼處死大鼠，然后取出大腦，在解剖顯微鏡下分離出右側(cè)海馬組織，以進行下一步實驗。

1.2.4 癡呆大鼠海馬AChE活性的檢測 行為學(xué)測試結(jié)束后，取海馬組織測試腦蛋白含量與乙酰膽堿酯酶活性。樣本處理、腦組織蛋白質(zhì)含量測定與AChE活性測定，參照穆俊霞等〔4〕實驗方法與試劑盒說明進行。

2 結(jié)果

2.1 CTG對Aβ25～35致癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 結(jié)果見表1，各實驗組與模型組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，說明造模成功，且陽性藥鹽酸多奈哌齊與CTG高、中、低劑量組均對Aβ25～35注射海馬致癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶有不同程度改善作用。通過對CTG高、中、低劑量組對大鼠航行潛伏期于120 s內(nèi)成功找到平臺次數(shù)的均數(shù)對比發(fā)現(xiàn)，存在一定的量效關(guān)系。故CTG對Aβ25～35注射海馬致癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶改善作用較為肯定。

2.2 CTG對Aβ25-35致癡呆大鼠海馬AChE活性的影響 結(jié)果見表2，CTG高、中、低劑量組均與假手術(shù)組(NS組)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果表明CTG可明顯降低大鼠海馬組織AchE活性，這可能是其改善學(xué)習(xí)記憶的機制之一。

表1 大鼠學(xué)習(xí)記憶成績()

表1 大鼠學(xué)習(xí)記憶成績()

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 劑量 n 學(xué)習(xí)記憶成績潛伏期(s) 成功次數(shù)(次)假手術(shù)組 生理鹽水 12 790.00±98.882) 3.50±1.902)模型組 生理鹽水 10 899.36±77.44 1.30±0.92鹽酸多奈哌齊 3 mg·kg－1·d－1 13 611.92±171.282) 4.31±2.352)CTG 高劑量組 14 g·kg－1·d－1 13 606.40±192.202) 5.00±2.392)CTG 中劑量組 7 g·kg－1·d－1 10 620.64±167.202) 4.40±2.302)CTG低劑量組 3.5 g·kg－1·d－1 11 727.12±179.601) 3.55±2.461)

表2 大鼠海馬AChE活力指數(shù)()

表2 大鼠海馬AChE活力指數(shù)()

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01

組別 劑量 n AChE活力(U/mgprot)12 13.80±1.14模型組 等體積生理鹽水 10 14.33±2.00鹽酸多奈哌齊 3 mg·kg－1·d－1 13 9.80 ±1.261)CTG 高劑量組 14 g·kg－1·d－1 13 10.38±2.051)CTG 中劑量組 7 g·kg－1·d－1 10 10.72 ±1.991)CTG 低劑量組 3.5 g·kg－1·d－1 11 11.56±2.331)假手術(shù)組 等體積生理鹽水

3 討論

學(xué)習(xí)記憶能力減退是各型癡呆患者最主要的共同臨床癥狀，改善學(xué)習(xí)記憶能力是各種類型治療藥物力爭達到的共同目標。對老年性癡呆的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)控制病情，對癥治療，尚無根治方法。其治療有專以從腎虛而論，或?qū)Ｒ詮母味?，或?qū)Ｒ詮酿龆?，或痰瘀而論，或分型而論，或雜合而論等，不一而足〔5〕。我們在總結(jié)前賢治療VD的基礎(chǔ)上，進一步認識到腎虛精虧，腦失濡養(yǎng)是貫穿于VD全過程的主要發(fā)病基礎(chǔ)，而氣虛血瘀、腦絡(luò)失暢又是導(dǎo)致本病發(fā)生矛盾的主要方面。故提出治療以“補腎填精，益氣活血”為主，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究成果〔6〕研制出了CTG(該方由絞股藍、人參、三七、淫羊藿等藥物組成)。全方共奏益氣益智、活血化淤，滋補肝腎、行氣化濕開竅等多方面功效，組方科學(xué)、標本兼顧。多藥合用，使虛得以補，髓得以充、瘀得以散，痰得以消，毒得以解，竅得以開，瘀血、痰濁、腑實、邪毒之病理之證得消而邪去正安，立意明確，遣藥精當。

本實驗改進了造模方法，經(jīng)預(yù)實驗向大鼠右側(cè)海馬區(qū)注射藍色墨水，2 d后在解剖顯微鏡下解剖觀察，結(jié)果表明在頭顱定位，開顱方法，進針深度、精確度方面與目前文獻常用方法相比較，具有定位精確度高，手術(shù)損傷小，大鼠死亡率低，造模成功率高，操作簡易，成本低廉的特點，值得推廣。

Aβ對神經(jīng)元的毒性作用與AD的發(fā)生密切相關(guān)。本研究采用致早老性癡呆的經(jīng)典動物模型，將經(jīng)過老化處理的聚集狀態(tài)Aβ25-35注射到大鼠海馬，促使動物產(chǎn)生癡呆樣癥狀，同時治療給藥。采用Morris水迷宮檢測動物的學(xué)習(xí)記憶能力;采用生化測定的方法，觀察大鼠海馬AChE的活力變化。從而觀察CTG對AD模型大鼠的益智作用，并探討了其可能作用機制。

本實驗結(jié)果表明CTG高、中、低劑量組均對Aβ25-35注射海馬致癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶有不同程度改善作用，且存在量效關(guān)系，結(jié)果較為可信，且CTG可抑制大鼠海馬組織AchE活性，這可能是CTG改善學(xué)習(xí)記憶的藥理機制之一。

1 Geddes JW，Tekirian TL，Soultanian NS，et al.Comparison of neuropathologic criteria for the diagnosis of Alzheimer's disease〔J〕.Neurobiol Aging，1997;18(1):99-105.

2 鄧家剛，郝二偉，郭宏偉，等.老年性癡呆復(fù)方用藥規(guī)律探討〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2007;66(6):363-5.

3 鐘振國，屈澤強，鮑運平，等.三七總皂苷對SD大鼠空間探索學(xué)習(xí)記憶力的影響〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006;29(1):34-7.

4 穆俊霞，李新毅.中藥遠志對阿爾茨海默病大鼠模型學(xué)習(xí)記憶和膽堿酯酶活性的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007;2(1):18-20.

5 尹宗寧.中醫(yī)藥防治老年癡呆癥的研究進展〔J〕.中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2005;25(3):354-5.

6 鄧家剛，杜正彩，郝二偉.復(fù)方絞股藍對小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)單胺氧化酶活性的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007;2(12):692-4.