醛固酮對人腎小管上皮細胞表達纖溶酶原激活物抑制物-1和纖維連接蛋白的影響

孫東立 李曉東 (唐山市工人醫院腎內科，河北 唐山 063000)

腎間質纖維化是各種原因所致慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同途徑〔1〕。腎間質纖維化的本質就是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的異常沉積，而ECM過度合成和降解受抑制是ECM積聚的直接原因〔2〕。最近研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)在腎間質纖維化的發病機制中起著重要作用〔3〕，可促進體外培養的腎小管上皮細胞表達致纖維化的細胞因子，如轉化生長因子(TGF)-β1、結締組織生長因子(CTGF)等〔4，5〕。但ALD是否通過調節ECM的合成和降解導致腎間質纖維化的進展，目前尚未見報道。本研究通過觀察ALD對人腎小管上皮細胞表達纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和纖維連接蛋白(fibronectin，FN)的影響，以探討ALD在腎間質纖維化發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人近端腎小管上皮細胞HK-2細胞購自中國協和醫科大學細胞中心(來源于美國ATCC)。D-ALD(美國Sigma)，Trizol試劑(美國 Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(美國 Promega)，FN ELISA試劑盒(武漢博士德)，胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養基(美國Gibco)。

1.2 細胞培養及藥物干預 HK-2細胞培養于含5%FBS的DMEM/F12培養液中，實驗前用無血清培養液同步化24 h。參照文獻〔6〕及預試驗結果，分別加入終濃度為 0、10－11、10－10、10－9、10－8mol/L ALD 含 5%FBS 的 DMEM/F12 培養液刺激HK-2細胞48 h。

1.3 半定量RT-PCR法檢測細胞中PAI-1和FN mRNA的表達 Trizol提取細胞總RNA，瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性，測定A260/A280均＞1.8。取2 μg RNA反轉錄為 cDNA。應用Primer Premier 5軟件設計引物，PAI-1(431 bp):正義5'-GTA TCT CAG GAA GTC CAG CC-3'，反義 5'-TCT AAG GTA GTT GAA TCC GAG C-3';FN(639 bp):正義5'-CGAAATCACAGCCAGTAG-3'，反義 5'-ATC ACA TCC ACA CGG TAG-3';β-actin(202 bp):正義5'-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3'，反義5'-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3'。引物由上海生工合成。PCR反應條件為:94℃變性5 min;然后94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 45 s，共30個循環;再于72℃延伸7 min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中掃描成像、分析電泳條帶灰度值。計算目的基因與內參β-actin灰度值的比值，即得目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 ELISA法檢測細胞培養上清液中FN的含量 收集細胞上清液，ELISA法檢測細胞上清液中FN的含量，按試劑盒說明書操作。

1.5 統計學分析 應用SAS8.1統計軟件，計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩均數比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 ALD對HK-2細胞中PAI-1和FN mRNA表達的影響 半定量RT-PCR結果顯示，正常HK-2細胞中有少量PAI-1和FN基因表達，不同濃度的ALD刺激HK-2細胞48 h后，其表達量與對照組比較均明顯增加，且呈一定的劑量依賴性(P＜0.05)。見圖1。

圖1 ALD對HK-2細胞中PAI-1和FN mRNA表達的影響

2.2 ALD對HK-2細胞培養上清液中FN含量的影響 正常HK-2細胞培養上清液中有一定含量的 FN〔(96.7±10.5)ng/ml〕，10－11、10－10、10－9、10－8mol/L 濃度的 ALD 刺激細胞48 h后，培養上清液中FN的含量分別為(126.0±12.3)、(135.3±17.6)、(148.4 ±14.4)、(161.2 ±15.1)ng/ml，均明顯增加，且具有一定的劑量依賴性(P＜0.05)。

3 討論

在腎間質纖維化的過程中，ECM并不是靜止不動的，而是處在不斷代謝更新、降解重塑的動態平衡中〔7〕。ECM合成增加和降解減少是ECM過度積聚的直接原因。PAI-1是纖溶酶原激活物最重要的抑制劑，許多腎臟疾病(如腎小球腎炎、新月體性腎炎、IgA腎病、狼瘡性腎炎等)腎組織局部PAI-1表達上調，PAI-1的變化在腎間質纖維化的發生和發展中起著重要作用〔8〕。TGF-β1、CTGF、腫瘤壞死因子-α、表皮生長因子等對PAI-1均具有上調作用〔9～11〕。本實驗結果顯示，ALD呈劑量依賴性地促進HK-2細胞PAI-1的基因表達。PAI-1的表達增加將抑制纖溶酶原激活物t-PA和u-PA的生物學功能，使纖溶酶原轉變為纖溶酶減少，引起ECM降解障礙，導致ECM合成和降解失衡，ECM過度積聚，從而在腎間質纖維化的過程中發揮作用。

腎間質纖維化過程中，沉積在腎間質的ECM成分主要有FN和膠原等。FN是這一過程中首先出現的ECM，起支架作用，對介導細胞遷移、黏附及其他ECM成分的沉積起重要作用，其變化顯示了ECM質和量的改變〔12〕。本實驗從基因和蛋白質兩個水平研究ALD對HK-2細胞表達FN的影響，結果顯示，ALD呈劑量依賴性地促進HK-2細胞合成和分泌FN，從而促進腎間質ECM積聚，導致腎間質纖維化的發生、發展。

因此，ALD可能通過促進HK-2細胞ECM的合成，并上調PAI-1的表達，抑制ECM降解，兩種機制共同作用促進腎間質纖維化的進展。拮抗ALD對HK-2細胞的作用可能成為防治腎間質纖維化的新途徑。

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