甲珠對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達的影響

付德才 張煒婷 樊麗萍 孫鈺瑋 (牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

肝狀細胞(HSC)的活化是肝纖維化的中心環節，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是HSC是否激活的重要標志物，α-SMA的存在表明肝纖維化時HSC是激活的HSC，能合成大量ECM，是肝纖維化主要的來源細胞。中醫方藥對肝纖維化有很好的治療效果，并已展示良好的應用前景〔1，2〕。甲珠為穿山甲的鱗片，主歸肝經，具有軟堅、通絡、散結的功效，是歷代醫家治療癥、瘕、集、聚的常用藥，近年來被廣泛用于治療肝硬化，取得了較好的臨床效果。但目前國內外尚無甲珠抗肝纖維化的基礎及臨床研究。本實驗采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纖維化模型，觀察甲珠對實驗大鼠肝細胞損害及肝纖維化發生的防治作用，探討甲珠保護肝組織及抗肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及藥物 雄性22月齡Wistar大鼠108只，體質量(180±30)g，由吉林大學實驗動物中心提供。甲珠(牡丹江中醫院提供)研細末，高劑量組為2.0 g/kg(體質量)，中劑量組為1.0 g/kg(體質量)，低劑量組為0.5 g/kg(體質量)。

1.1.2 藥品及試劑 CCl4購自北京北化精細化學品有限責任公司;秋水仙堿(colchicine)購自昆明股份制藥有限公司;單克隆即用型鼠抗人α-SMA購自北京中山生物試劑公司。Trizol購于DingGuo公司，DEPC購于 Sigma公司，dNTPs購于日本Takara，PCR引物購于上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 參照文獻〔3〕方法，實驗第1天除正常對照組(簡稱對照組)外，其余動物予CCl4分析純5 ml/kg體重，以后每隔3 d注射400 ml/L CCl4橄欖油劑3 ml/kg體重，連續8 w，實驗前2 w飼喂高脂玉米粉飼料(795 g/kg玉米粉 +200 g/kg豬油 +5 g/kg膽固醇)，第 3～6周飼喂玉米粉1 000 g/kg和乙醇飲料300 ml/L。

1.2.2 分組及給藥方法 采用成組設計，將108只大鼠隨機分為6組，每組18只，第1組正常對照組，飼喂正常飲食;第2組模型組，按上述造模方法給予飲食;第3組秋水仙堿組，于造模第3周開始給予秋水仙堿0.1 mg·kg－1·d－1;第4組甲珠高劑量組，于造模第3周開始給予甲珠混懸液灌胃，2.0 g·kg－1·d－1;第5組甲珠中劑量組，于造模第3周開始給予甲珠混懸液灌胃，1.0 g·kg－1·d－1;第6組甲珠高劑量組于造模第3周開始，給予甲珠混懸液灌胃，0.5 g·kg－1·d－1，共8 w，造模結束時模型組死亡3只，中劑量組死亡3只，低劑量組死亡2只，秋水仙堿組死亡2只，高劑量組死亡1只，為增加可比性，每組均采用15只。

1.2.3 標本制作 上述造模及處理過程結束日，禁食12 h后稱質量，股靜脈取血，分離血清置－20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質量后用生理鹽水漂洗肝左葉數次，濾紙拭干后，切取0.2 g置于冰浴中的組織勻漿器內，加入冰生理鹽水2 ml，制備成100 g/L肝組織勻漿，4 000 r/min 4℃離心，取上清液保存于－20℃。肝右葉置于40 g/L中性甲醛液中常規固定，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

1.3 檢測指標

1.3.1 病理檢測 組織芯片分別行常規HE染色、Masson三色染色(染膠原纖維)及網織纖維染色，光鏡下觀察，根據王泰齡等改進的肝纖維化半定量評分系統(SSS)〔4〕進行炎癥活動度及肝纖維化程度計分。

1.3.2 免疫組化SP法檢測肝組織α-SMA含量 取肝左葉放入10%中性磷酸甲醛液中固定，取肝左葉最大橫截面石蠟包埋切片，進行α-SMA免疫組織化學染色。免疫組織化學染色步驟:石蠟切片脫蠟、水化后，PBS沖洗3次，每次3 min;對組織進行微波修復;PBS沖洗3次，每次3 min;加試劑A過氧化酶阻斷溶液，阻斷內源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min;PBS沖洗3次，每次3 min;加試劑B正常山羊血清封閉，室溫下孵育10 min;甩去血清，加相應的一抗1∶100稀釋，4℃過夜;PBS沖洗3次，每次3 min;加試劑C生物素標記的第二抗體1∶60稀釋，室溫下孵育25 min;PBS沖洗3次，每次3 min:加試劑D鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育25 min;PBS沖洗3次，每次3 min;加新鮮配制的二氨基聯苯二胺鹽酸鹽(DAB)溶液顯色;自來水沖洗，蘇木素復染，分化返藍，切片經梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

在全自動圖像分析系統上，采用HPIAS-2000型圖像分析軟件進行定量分析，隨機選取每張切片10個視野(×200)測定陽性細胞的灰度值與所占視野面積，灰度值在0～249之間，灰度值越高，染色越淺，表達產物越少;灰度值越低，染色越深，表達產物越多。

1.3.3 RT-PCR法檢測肝組織α-SMA mRNA 大鼠GAPDH上游引物:5'-CATGGTCTACACGTTCCAGT-3'，下游引物:5'-CATTGAGAGCAATGCCAGCT-3'，全長 785 bp;TGFβ1上游引物:5'-ACTACTGCTTCAGCTCCACA-3'，下游引物:5'-ATCATGTTGGACAACTGCTC-3'，全長 301 bp;α-SMA 上游引物:5'-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3'，下游引物:5'-CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3'，全長 493 bp。

大鼠肝組織總RNA的提取按Trizol試劑盒操作說明進行。①從液氮罐中取出100 mg肝組織放入冰浴的研磨器內，加入1 ml Trizol，使用電動勻漿機充分研磨，直到液體不再黏稠;②將裂解物移到2 ml離心管內，室溫放置5～10 min;③加入0.2 ml氯仿，震蕩混勻 15 s，室溫放置10 min;④12 000 r/min，4℃離心10 min;⑤取上層水相，加0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置10 min;⑥12 000 r/min，4℃離心10 min;⑦棄上清，加 1 ml 75%乙醇，不要混勻，7 500 r/min，4℃離心5 min;⑧棄上清，室溫晾干5～10 min，不要完全干燥;⑨用10 μl/1 000 DEPC處理水溶解;⑩取2 μl稀釋后在紫外分光光度計上測濃度。

在紫外分光光度計上測定核酸260 nm和280 nm的吸收值，判斷RNA質量和濃度。如OD260/OD280＞1.8，證明純度較高。核酸濃度的計算:RNA的濃度(μg/ml)=40×稀釋倍數×OD260值。

1.3.4 RT-PCR 肝組織總RNA經紫外分光光度計測量，每個樣本取5 μg RNA在 AMV逆轉錄酶作用下合成 cDNA，即42℃水浴60 min，95℃水浴5 min滅活AMV。PCR反應體系為100 μl，反應條件:94℃變性30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，擴增30個循環;72℃延伸10min，同法擴增GAPDH作為內參照。取5 μl PCR產物150 ml/L瓊脂糖凝膠電泳 30 min(100 V)，用圖像分析儀掃描底片上PCR產物帶，以內參GAPDH為基準，作半定量，即以目的基因擴增量/GAPDH擴增量表示所擴增目的基因片段的相對表達水平。

2 結果

2.1 免疫組化結果 α-SMA在胞質表達，正常對照組只表達于小動脈及小靜脈，在膽管無表達。模型組α-SMA主要表達于匯管區及纖維間隔，且呈長橢圓形或梭形。模型組α-SMA免疫組織化學染色灰度值明顯降低，表達產物增加，陽性染色程度增加，顯著高于正常組(P＜0.01)。實驗表明不同劑量甲珠與秋水仙堿灌胃防治后，較模型組α-SMA灰度值升高，表達產物減少，陽性染色程度不同程度減輕(P＜0.01);模型組α-SMA免疫組織化學染色陽性面積明顯升高，顯著高于正常對照組(P＜0.01)。甲珠治療各組及秋水仙堿干預組染色陽性面積明顯低于模型組(P＜0.01)。見表1。

2.2 RT-PCR結果 正常肝組織不表達α-SMA mRNA，模型組較正常對照組明顯增強;不同劑量甲珠(2.0、1.0、0.5 g/kg)與秋水仙堿(0.1 mg/kg)灌胃組α-SMA mRNA表達明顯減少，與模型組比較差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。見表2，圖1。

2.3 大鼠肝組織病理變化

2.3.1 HE染色 正常對照組大鼠肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整、清晰，肝細胞大小、形態一致。模型組大鼠肝細胞腫脹，肝細胞彌漫性水樣變性和脂肪變性，肝竇及中央靜脈明顯擴張，肝索排列紊亂，門管區及肝小葉內可見明顯的灶性淋巴細胞浸潤，可見間質細胞大量彌漫性增生，分隔包繞肝細胞，部分區域形成細胞纖維間隔，或纖維細胞間隔，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔成大小不等的肝細胞團，假小葉形成。甲珠干預各組肝細胞有不同程度的變性壞死，匯管區及小葉間有少量纖維組織增生，纖維間隔細小，肝細胞索排列較整齊，肝小葉結構基本完整，間質有少量炎性細胞浸潤，但較模型組減輕，與模型組比較纖維化程度差異顯著。秋水仙堿干預組肝細胞有不同程度的變性壞死，匯管區及小葉間有少量纖維組織增生，肝細胞內可見脂肪沉積。

表1 各組大鼠肝組織α-SMA的染色灰度值及染色陽性面積(n=15，)

表1 各組大鼠肝組織α-SMA的染色灰度值及染色陽性面積(n=15，)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 α-SMA灰度值 α-SMA陽性面積(%)正常對照組14.23±1.41 116.44±12.60 1.48 ±0.24模型組 79.518±9.811) 16.32±1.751)秋水仙堿組 103.74±17.692) 9.45±1.27甲珠高劑量組 109.18±17.542) 9.21±1.29甲珠中劑量組 100.7±13.092) 12.63±1.44甲珠低劑量組 98.70±9.792)

表2 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA/GAPDH mRNA比較(n=15，，%)

表2 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA/GAPDH mRNA比較(n=15，，%)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

-SMAmRNA/GAPDH正常對照組組別 α 14.23±1.57 1.48±0.24模型組 16.32±2.141)秋水仙堿組 9.46±1.202)甲珠高劑量組 9.21±1.122)甲珠中劑量組 12.63±2.422)甲珠低劑量組

圖1 肝纖維化大鼠肝組織α-SMA mRNA RT-PCR凝膠電泳結果

2.3.2 大鼠肝組織Masson三重膠原染色 Masson三重膠原染色可見:正常組大鼠肝小葉結構正常，肝索排列規則，小葉周邊僅見少量膠原纖維呈綠色，染色較輕。模型組大鼠肝組織膠原纖維明顯增生，沿匯管區或炎癥壞死區向外延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成。甲珠干預各組肝組織也有少量綠色的膠原纖維增生，主要分布于肝臟間質內，部分向肝小葉內伸展，且膠原纖維較纖細，部分區域可見膠原纖維沿炎癥壞死區延伸，形成間斷、薄的纖維間隔，無明顯假小葉形成。秋水仙堿組介于治療組和模型組之間。Masson膠原染色定量分析結果表明，模型組膠原顯色指數明顯高于正常對照組(P＜0.01)，甲珠高劑量組、中劑量組和秋水仙堿組膠原顯色指數顯著低于模型組(P＜0.01)，甲珠低劑量組膠原顯色指數明顯低于模型組(P＜0.05)。

3 討論

Hyp是構成膠原纖維的特異氨基酸成分，肝組織Hyp的含量可較準確地反映肝組織膠原纖維含量。在肝纖維化實驗研究中，常以此指標來反映膠原纖維增生的程度。本實驗結果顯示，CCl4誘發大鼠肝纖維化后肝組織Hyp顯著升高，與正常組形成顯著差異，說明膠原增生十分活躍，與以往報道結果相符。經甲珠各組治療后其含量明顯降低，其中高劑量組尤為明顯。表明甲珠對實驗性大鼠肝纖維化程度具有較好的防治作用。

研究表明脂質過氧化是肝纖維化發生途徑中的重要環節之一。機體受到外界環境的氧化損傷后產生大量自由基攻擊細胞膜導致脂質過氧化，使肝細胞損傷和壞死，最終導致肝纖維化的形成。在CCl4誘發的肝纖維化發生機制中，自由基的肝損傷作用尤為突出。氧自由基可促使不飽和脂肪自由基形成，脂質自由基可引起細胞膜的流動性、通透性和完整性的破壞，進而使其雙層結構發生斷裂，引起膜鑲嵌的一系列酶的排列紊亂、功能喪失，細胞的能量產生系統癱瘓。MDA是脂質過氧化的最終產物，可嚴重破壞細胞膜的結構，導致細胞腫脹、壞死，其含量反映了組織過氧化的損傷程度〔5～8〕。SOD的變化可以間接地反映疾病情況下自由基的變化。SOD為高效的清道夫，可抑制自由基啟動的脂質過氧化，從而起到保護細胞膜結構與功能完整的作用〔9〕。氧化應激和脂質過氧化是引起肝細胞損傷和HSCs活化的重要機制〔10〕，在肝纖維化的發生發展過程中有氧自由基的產生，隨后的脂質過氧化產物(如MDA)可通過JUK通路激活HSCs I型膠原α2基因表達，進而促進肝纖維化的發生。在多種肝纖維化模型中均發現肝臟MDA含量升高及GSH水平降低〔11，12〕。甲珠治療后能明顯降低肝組織中Hyp、MDA含量，提高SOD的水平，從而增強肝臟清除自由基的能力，減少肝臟脂質過氧化損傷，進而減少ECM的形成，減輕肝細胞損傷，發揮其保護肝臟和抗肝纖維化的作用。

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