尿酸誘導樹突狀細胞成熟的信號轉導機制研究*

馬曉軍， 伍定輝， 陳小蘋， 田德英

(1廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院感染科，廣東 廣州 510080;2廈門市第一醫院杏林分院肺科，福建 廈門 361001;3華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院感染科，湖北 武漢 430060)

樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)在獲得性免疫應答中占據關鍵位置。我們在前期研究中已證實，尿酸分子可以刺激DCs成熟，可增強乙肝DCs疫苗的免疫效應［1，2］。本研究中，我們進一步對尿酸刺激DCs成熟過程中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)信號通路(ERK1/2、p38、JNK)及核因子NF－κB的信號活化情況進行觀察，以探討尿酸刺激DCs成熟的分子機制，進一步闡述尿酸作為乙肝治療性疫苗免疫佐劑的作用機理。

材料和方法

1 主要試劑

尿酸(uric acid，UA)購自 Sigma－Adrich，按5 g/L濃度溶解在0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.5～9.0)中，靜置 72 h 以上［2，3］。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)為Sigma產品，以PBS配制成20 mg/L，滅菌后4℃貯存。p38 MAPK抑制劑SB203580、ERK1/2抑制劑 PD98059、JNK抑制劑 SP600125和NF－κB抑制劑PDTC均購自Santa Cruz。使用前溶于DMSO。兔抗磷酸化的ERK單克隆抗體、兔抗磷酸化的p38單克隆抗體、兔抗NF－κB p65亞基的多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自Santa Cruz。細胞核蛋白質提取試劑盒NE－PERTM nuclear and cytoplasmic extraction reagent、T － PERTM tissue protein extraction reagent及BCA protein assay reagent均為Pierce產品。預染蛋白marker購自碧云天生物技術研究所。ECL:分A和B 2種試劑，為Santa Cruz產品。

2 大鼠骨髓來源樹突狀細胞的培養

見前期研究［1，2］，體外分離培養獲得未成熟DCs。

3 ERK1/2、p38、JNK 信號蛋白及 NF － κB p65蛋白的檢測

3.1 DCs的刺激及收集 收獲前述按常規方法培養7 d的DCs，調整細胞濃度為1×109cells/L，分于數個Eppendorf管，每管1 mL，置37℃、5%CO2箱孵育。以1 mg/L LPS刺激45 min作為陽性對照，僅加DMSO處理的為陰性對照。用200 mg/L尿酸(為排除LPS污染，同時加入50 mg/L多黏菌素B)或尿酸聯合各抑制劑 (SB20358020 μmol/L、PD9805940 μmol/L、SP60012520 μmol/L 或 PDTC 20 μmol/L)刺激15、30、45 min，調整刺激開始的時間，使上述刺激同時結束。然后立即收獲細胞，準備提取細胞蛋白和細胞核。

3.2 樹突狀細胞總蛋白與核蛋白的提取 (1)樹突狀細胞總蛋白的提取:經刺激后，即刻離心DCs，沉淀細胞，棄上清，用T－PERTM tissue protein extraction reagent提取全蛋白，然后用BCA法測定濃度。調節至前后左右一致后，樣品每20 μL與4 μL 6倍蛋白上樣緩沖液混勻，于100℃水浴煮沸5 min后，－20℃貯存備用。(2)樹突狀細胞核蛋白的提取:經刺激過的 DCs細胞用 PBS洗1遍后，用NEPERTM nuclear and cytoplasmic extraction reagent提取核蛋白，同上述方法將蛋白濃度調節一致，樣品加入蛋白上樣緩沖液于100℃水浴煮沸5 min后，－20℃貯存備用。(3)SDS－PAGE電泳:制作15%SDS－PAGE凝膠電泳分離膠10 mL;按序加樣，每條加樣槽加50 μg蛋白提取液，用β肌動蛋白(βactin)作為內參照。電泳、蛋白轉移到PVDF膜上，麗春紅染色并標記方向，標出marker所在位置。先后加入Ⅰ抗，兔抗 NF－κB p65抗體(1∶1000)、β －actin單克隆抗體，Ⅱ抗(1∶5000的羊抗兔HRP標記IgG);ECL顯色。(4)分析數據:膠片攝像，用SensiAnsy凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈吸光度值。計算其與β－actin的比值。

4 信號轉導分子抑制劑對DCs表面分子表達及IL－12 p70分泌水平的影響

4.1 樹突狀細胞的刺激培養 按常規方法培養第7 d的DCs，加入200 mg/L尿酸和重組細胞因子刺激培養48 h，同時分別加入信號轉導分子抑制劑p38 MAPK 抑制物 SB203580(20 μmol/L)、ERK1/2 抑制物 PD98059(40 μmol/L)、JNK 抑制物 SP600125(20 μmol/L)和NF－κB 抑制物PDTC(20 μmol/L)培養。以未用信號轉導分子抑制劑為平行對照組，僅加等量DMSO處理的為陰性對照。

4.2 DCs表面分子測定 48 h后收集細胞，熒光染色后流式細胞儀測定CD83、CD86和IA/IE的表達。

4.3 IL－12 p70的分泌水平 收集細胞上清，嚴格按ELISA試劑盒說明進行操作，酶標儀檢測IL－12 p70的分泌水平。簡言之，抗小鼠IL－12 p70單抗包被于酶標板上，先后加入標本和標準品、生物素化的抗小鼠IL－12抗體和辣根過氧化物酶標記的親合素，洗滌，再加入顯色劑、終止液等，在450 nm處測A值，通過繪制標準曲線求出標本中IL－12 p70濃度。

5 統計學處理

結 果

1 尿酸作用于DCs可引起部分信號轉導分子的激活

圖1中分析了尿酸不同作用時點信號轉導分子ERK、JNK和p38的磷酸化情況及NF－κB的核內轉位情況。尿酸刺激后15 min，p－ p38、p－ERK1/2、p－JNK和NF－κB p65表達量明顯增加，30 min時達到高峰，45 min時則開始下降，與DMSO對照組相比，P＜0.05。尿酸可使相關信號分子的活化程度提高4.5～5.9倍。使用抑制劑后，相應磷酸化信號蛋白表達不能測出。陽性對照組LPS組上述分子在45 min時仍大量表達，與尿酸30 min時表達值無顯著差異，P＞0.05。上述結果表明，尿酸刺激 DCs后，促進了p38、JNK、ERK等的磷酸化。NF－κB通常存在于胞漿中，在細胞核內檢測到NF－κB p65，提示尿酸誘發了NF－κB活化，促進了NF－κB向核內轉位。

2 信號轉導分子抑制劑對DCs成熟及分泌IL－12 p70水平的影響

DCs表面分子的表達如表1、圖2所示。與未用相應抑制劑相比，使用 SB203580、SP600125、PDTC等抑制劑處理后，DCs表面分子表達和IL－12 p70分泌水平均出現下降。其中，以SB203580的作用最明顯。使用PD98059后，則出現DCs表面分子表達和IL－12 p70分泌出現相反的變化趨勢。

與尿酸單獨刺激組比較，使用 SB203580后，CD83、CD86表達和 IL－12 p70分泌明顯下降(P＜0.01)，IA/IE表達出現下降(P＜0.05);使用SP600125后，CD83、CD86表達和IL－12 p70分泌明顯下降，IA/IE表達輕度下降(P＞0.05);使用PDTC后，CD86的表達明顯下降(P＜0.01)，CD83和IA/IE表達出現下降(P＜0.05)，而IL－12 p70的分泌輕度下降(P＞0.05);使用 PD980059后，CD83、CD86、IA/IE表達及IL－12 p70分泌水平則出現上升(P＜0.05)。

表1 各組DCs表面分子表達及分泌IL－12 p70水平的影響Table 1.Expression of molecules on the surface of DCs and IL－12 p70 production in DCs(.n=5)

表1 各組DCs表面分子表達及分泌IL－12 p70水平的影響Table 1.Expression of molecules on the surface of DCs and IL－12 p70 production in DCs(.n=5)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs DMSO;*P＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs DMSO+UA.

Group CD83(%) CD86(%) IA/IE(%) IL－12 p70(μg/L)DMSO 22.37 ±4.78＊＊ 36.32 ±2.79＊＊ 29.28 ±3.21＊＊ 2.62 ±0.25＊＊DMSO+UA 51.78 ±5.87△△ 80.28 ±3.52△△ 78.92 ±3.38△△ 4.21 ±0.29△△SB203580+UA 36.73 ±3.16△△＊＊ 43.48 ±3.28△＊＊ 73.09 ±2.52△△＊ 3.12 ±0.27△＊＊PD98059+UA 58.81 ±3.25△△＊ 84.98 ±2.44△△＊ 84.68 ±3.47△△＊ 4.87 ±0.29△△＊SP600125+UA 43.92 ±4.35△△＊ 74.45 ±3.21△△＊ 78.36 ±4.15△△ 3.46 ±0.34△△＊PDTC+UA 39.87 ±5.31△△＊ 51.47 ±4.32△△＊＊ 71.36 ±5.34△△＊ 3.85 ±0.31△△

討 論

作為內源性“危險信號”的尿酸，具有誘導DCs成熟的良好佐劑活性，但其信號轉導途徑至今尚未闡明。研究表明，MAPKs、核因子κB等信號通路激活是DCs成熟的重要機制。NF－κB通路已證實對DCs成熟有著重要作用，如NF－κB基因敲除小鼠的DCs存在嚴重功能缺陷［4］。LPS、TNF－ α 以及半抗原DNCB、Nicl2等對DCs刺激的實驗中發現，不同的DCs成熟刺激劑能通過控制和平衡ERK、JNK和p38 MAPK等MAPKs的磷酸化，從而誘導DCs成熟和激發相應的免疫反應;使用不同信號分子抑制劑阻斷相應信號通路，對 DCs的成熟具有明顯不同影響［5－8］。

本研究觀察到，對小鼠骨髓來源的未成熟DCs，尿酸刺激 15 min后，即可見 ERK1/2、JNK、p38 MAPK及NF－κB等信號分子的磷酸化蛋白，30 min后到達高峰;使用抑制劑后，相應磷酸化信號蛋白表達不能測出。這表明，DCs的MAPKs及NF－κB信號通路可被尿酸所激活。

Figure 1.Expression of signal transduction molecules in dendric cells simulated by uric acid.DCs were obtained from murine bonemarrow and cultured in vitro.After immature DCs were stimulated with uric acid(200 μg)and NF － κB inhibitor PDTC(20 μmol/L)or MAPKs inhibitors SB203580(20 μmol/L)，PD98059(40 μmol/L)or SP600125(20 μmol/L)for 15，30 or 45 min，cytoplasmic or nuclear extracts were collected and were subject to immunoblot analysis with specific antibodies.Cell lysates from DCs treatment with LPS or DMSO served as controls.A:expression of p－p38;B:expression of p－ERK1/2;C:expression of p－JNK;D:expression of NF－κB p65..n=5.#P＜0.05 vs DMSO.圖1 尿酸刺激樹突狀細胞信號分子蛋白活化表達

大量表達共刺激分子和分泌IL－12是DCs成熟的重要標志。本研究進一步發現，抑制p38、JNK、NF－κB等信號通路，尿酸誘導的CD83、CD86和IA/IE表達受到明顯抑制，IL－12 p70分泌下降;抑制ERK1/2信號通路，則促進了CD86、CD83、IA/IE表達，提高了IL－12 p70的分泌。這表明，MAPKs及NF－κB等信號活化及效應強度的平衡直接影響到尿酸刺激DCs表型和功能成熟程度;p38 MAPK、JNK信號蛋白的活化起著正向調節作用，而ERK信號通路則負向調節。其中，p38 MAPKt和NF－κB通路對尿酸刺激DCs成熟過程中起著主導作用。

綜上所述，本研究結果表明，尿酸能刺激樹突狀細胞 MAPKs(p38、ERK1/2和 JNK)、NF－κB 等信號通路的活化，而上述信號通路的活化程度及持續效應時間則決定著DCs成熟程度，這可能是尿酸誘導DCs成熟的分子機制之一。該發現將為尿酸作為乙肝疫苗免疫佐劑的應用提供科學依據;也為以DCs作為靶細胞，通過MAPKs抑制劑調節DCs的成熟和功能，進而調控機體免疫反應的應用研究建立科學基礎。

Figure 2.Effect of signal transduction molecule inhibitors on expression of molecules on the surface of DCs and IL－12 p70 production in DCs.DCs were obtained from murine bone－marrow and cultured in vitro.After treatment with uric acid and PDTC(20 μmol/L)，SB203580(20 μmol/L)，PD98059(40 μmol/L)or SP600125(20 μmol/L)for 48 h，DCs were collected.Cell surface markers were analyzed by flow cytometry.IL－12 p70 production in cultured cell supernatants was detected using ELISA..n=5.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs DMSO;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DMSO+UA.圖2 信號轉導分子抑制劑對DCs表面分子表達及IL－12 p70分泌水平的影響

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