雷帕霉素增強子宮內膜癌細胞對阿霉素的敏感性*

許成芳， 李小毛， 李 田， 王小韻

(中山大學附屬第三醫院婦科，廣東 廣州 510630)

子宮內膜癌是原發于子宮內膜的一種上皮性惡性腫瘤，是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一。近年來，子宮內膜癌的發病率在世界范圍內有所上升，但5年生存率卻逐年下降。目前，化療已經成為有小殘余病灶的晚期患者和高危早期患者的一線治療方案［1］。

阿霉素(adriamycin，ADM)是傳統的子宮內膜癌一線化療藥物，其抗腫瘤機制主要是嵌入RNA或DNA中而抑制核酸合成，導致細胞凋亡［2］。阿霉素在臨床上的應用日益廣泛，但是阿霉素在治療劑量時產生非特異性的毒副作用，病人往往很難耐受，大大限制了阿霉素在臨床上的應用。因此，減少阿霉素的臨床用量，降低毒副作用已成為成為阿霉素應用的關鍵。大量研究表明特異性抑制PI3K(phosphatidylinositol－3－kinase)/Akt(protein kinase B)通路的活性可減少腫瘤細胞的化療耐藥性，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是哺乳動物 PI3K/Akt通路的下游效應物，它通過PI3K/Akt的磷酸化而被活化的，從而調節細胞的增殖凋亡等［3］。以抑制mTOR為主要作用原理的雷帕霉素成為新的抗腫瘤藥物，并進入臨床開發的早期階段［4］。本研究擬將mTOR的抑制劑雷帕霉素(rapamycin，RA)與阿霉素聯合使用，觀察雷帕霉素是否增強阿霉素在子宮內膜癌細胞中敏感性，并探討相關分子機制。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株 人子宮內膜癌細胞株Ishikawa［PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)陰性］細胞及HEC－1A細胞(PTEN陽性)由中山三院中心實驗室保存。

1.2 試劑 胎牛血清購自Gibco;DMEM購自Hyclone;兔抗 p－Akt和caspase－3單抗購自Cell Signaling Technology;鼠抗人PTEN購自Santa Cruz Biotechnology;鼠抗β－actin多克隆抗體購自Sigma;細胞總蛋白提取試劑盒購自Pierce;蛋白分子量marker購自Fermentas;Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司;rapamycin購自Cell Signaling Technology;阿霉素購自Sigma。

2 方法

2.1 細胞培養 Ishikawa及HEC－1A于含10%胎牛血清的DMEM培養液中培養，培養條件在5%CO2、37℃及飽和濕度下進行。

2.2 細胞處理與分組 將rapamycin溶解在DMSO中，配成100 mmol/L的液體，于實驗當天用DMEM培養液稀釋，使DMSO的濃度在0.1%以下。并用培養基稀釋阿霉素。rapamycin稀釋后的濃度為10 nmol/L，阿霉素濃度為1 μmol/L。實驗分為4組:對照組(培養液+細胞)、rapamycin組、阿霉素組、rapamycin+阿霉素組。聯合用藥組為rapamycin作用24 h后再加阿霉素繼續作用24 h。

2.3 MTT檢測子宮內膜癌細胞的增殖情況及計算IC50值 以1×104cells/well接種于96孔板中，常規培養24 h，待細胞貼壁后，在細胞處于對數生長期時棄原培養基，加入4組干預藥物工作液。4組細胞處理24、48、72 h(每組設 3個復孔 )后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL繼續孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀讀取每孔的吸光度(absorbance，A)值。按下式計算細胞存活率(%)=A試驗組/A對照組×100%;細胞抑制率(%)=(1－A試驗組/A對照組)×100%。繪制細胞增殖曲線。

2.4 采用金正均法計算聯合指數(combination index，CI)判斷兩藥合用是否具有協同作用 公式:CI=Ea+b/(Ea+Eb－ Ea×Eb)，公式中Ea+b為聯合處理組的抑制率，Ea、Eb分別為a藥和b藥單獨處理的抑制率。若q值在0.85～1.15間為兩藥合用單純相加，若q＞1.15為有協同作用，若q＜0.85表示兩藥合用有拮抗作用。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 各組細胞加藥干預24 h后收集細胞，檢測細胞凋亡，培養基+細胞組作為空白對照。200 μL binding buffer重懸細胞，加入 10 μL Annexin V 和 4 μL PI(propidium iodide)，室溫中避光孵育30 min，最后加入300 μL binding buffer，1 h內流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件計算細胞凋亡率。每組實驗重復3次。

2.6 Western blotting檢測 提取細胞蛋白，BCA法定量，取等量樣本上樣于10%SDS－PAGE進行電泳分離，并電轉移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，加入ECL化學發光試劑檢測。結果采用圖形分析軟件Quantity One對條帶進行灰度掃描分析。

3 統計學處理

數據采用SPSS 11.5軟件進行非參數檢驗和方差分析。計量資料以均數±標準差()表示。

結 果

1 阿霉素、雷帕霉素單獨及合用對子宮內膜癌細胞增殖的影響

結果表明，阿霉素、雷帕霉素單獨使用對Ishikawa細胞和HEC－1A細胞的增殖均有明顯的抑制作用。抑制率與時間、劑量呈正相關。其中，雷帕霉素在Ishikawa細胞作用 48h的 IC50為(32.4±4.2)nmol/L，在 HEC －1A 細胞的 IC50為(179.7 ±22.8)nmol/L。阿霉素在Ishikawa細胞作用24 h的IC50為(21.3±3.8)μmol/L，而在 HEC －1A 細胞的 IC50為(14.3 ±2.8)μmol/L，見圖1。

Figure 1.The effects of rapamycin(RA)or/and adriamycin(ADM)on proliferation in HEC－1A cells(A)and Ishikawa cells(B)..n=3.圖1 雷帕霉素或/和阿霉素對子宮內膜癌細胞增殖影響

根據我們前期實驗數據，先用雷帕霉素10 nmol/L預處理24 h，然后用阿霉素處理Ishikawa細胞和HEC－1A細胞。結果顯示，與單用阿霉素組相比，兩藥合用組阿霉素24 h的 IC50分別降至(11.9±1.2)μmol/L(Ishikawa細胞)和(8.2±0.9)μmol/L(HEC－1A細胞)，差異顯著(P＜0.05)。阿霉素與雷帕霉素的聯合指數在Ishikawa細胞為1.85，而 HEC －1A 細胞為 1.47，均大于 1.15，提示阿霉素與雷帕霉素合用在子宮內膜癌細胞中有協同作用。

2 阿霉素、雷帕霉素單獨或合用對子宮內膜癌細胞凋亡率的影響

結果顯示，與對照組比較，阿霉素、雷帕霉素單獨使用時均能明顯誘導子宮內膜癌細胞的凋亡。雷帕霉素10 nmol/L預處理24 h后，阿霉素5 μmol/L作用24 h，HEC－1A細胞的凋亡率為(58.93±5.76)%，Ishikawa細胞的凋亡率為(48.61±4.35)%，較藥物單用組均有明顯升高，提示阿霉素與雷帕霉素合用能協同誘導細胞凋亡，見圖2。

3 阿霉素、雷帕霉素單獨或合用對caspase－3和PI3K/Akt磷酸化作用的影響

結果顯示，雷帕霉素10 nmol/L作用于HEC－1A及Ishikawa細胞48 h后，與對照組相比，p－Akt及活化的caspase－3蛋白的表達顯著增強，pmTOR蛋白的表達明顯減弱。阿霉素5 μmol/L作用于細胞24 h后，2株細胞中p－mTOR蛋白的表達均有不同程度的減弱，活化的caspase－3蛋白表達增強，其中HEC－1A細胞的變化更明顯。以上結果提示阿霉素對PI3K/Akt通路有抑制的作用，見圖3。

雷帕霉素10 nmol/L預處理24 h后，阿霉素5 μmol/L濃度再作用24 h，與單藥組相比較，2株細胞的p－Akt和p－mTOR蛋白的表達均有進一步的下降，活化的caspase－3表達則顯著增強，差異顯著(P＜0.05)，在 HEC－1A細胞中這種變化更加明顯。

Figure 2.The effects of RA or/and ADM on apoptosis of endometrial cancer cells.BC:blank control;RA:rapamycin treatment;ADM:adriamycin treatment;RA+ADM:rapamycin in combination with adriamycin treatment..n=3.*P＜0.05 vs RA or ADM.圖2 雷帕霉素或/和阿霉素誘導子宮內膜癌細胞凋亡

討 論

近年來，國外開展了多項針對早期高危子宮內膜癌術后輔助化療的隨機對照研究表明，化療對預防早期子宮內膜癌復發，治療晚期小殘余病灶具有良好的作用［5］。阿霉素是目前常用的治療子宮內膜癌的藥物。作為細胞毒性藥物，其抗腫瘤作用主要是通過引起不可修復的DNA破壞最終導致細胞凋亡的產生，然而，作為子宮內膜癌的一線化療藥物，該藥嚴重的毒副作用，以及腫瘤細胞對其產生的耐藥性都是導致腫瘤化療失敗的重要因素。因此，尋找減少耐藥、增強阿霉素療效的方法具有重要的臨床意義［6，7］。

Figure 3.The effects of RA or/and ADM on the expression of p－Akt，caspase－3 and p－mTOR in HEC－1A cells(A)and Ishikawa cells(B).BC:blank control;RA:rapamycin treatment;ADM:adriamycin treatment;RA+ADM:rapamycin in combination with adriamycin treatment..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs RA or ADM.圖3 雷帕霉素或/和阿霉素對子宮內膜癌細胞p－Akt、caspase－3和p－mTOR蛋白表達的影響

最近的研究顯示，分子靶向藥物與細胞毒性藥物聯合使用能夠降低藥物的使用劑量，增加抗腫瘤藥物的細胞毒性從而降低腫瘤細胞對藥物的耐藥性，提高化療藥物的療效［8－11］。雷帕霉素是大環內酯類的抗生素，也是最早被發現的mTOR抑制劑，主要通過阻斷腫瘤細胞的能量來源和有絲分裂過程達到抗腫瘤作用［12］。本研究結果證實，體外應用雷帕霉素作用于子宮內膜癌細胞株HEC－1A和Ishikawa可起到抑制增殖及誘導凋亡的作用。同時，我們研究還發現，雷帕霉素與阿霉素聯合使用抑制子宮內膜癌細胞的增殖效果較兩藥單獨使用好，這種抑制作用表現為良好的時間和劑量依賴性，協同作用明顯。更重要的是，兩藥合用后，阿霉素的IC50明顯降低，細胞凋亡率顯著升高，提示雷帕霉素能增加阿霉素的細胞毒性，從而降低阿霉素的起效劑量。作為聯合用藥，其劑量與用藥順序都很重要。本研究顯示提前24 h使用1/2～1/10的IC50劑量的抑制劑再加用1/4的IC50劑量的阿霉素，就能達到細胞抑制50%的效果。以上結果提示雷帕霉素能夠增強阿霉素抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用，在不影響藥物療效的前提下，可以減少阿霉素的臨床用量，減少阿霉素耐藥性的產生，這為開辟新的子宮內膜癌臨床化療方案提供了思路。

PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路不僅與細胞的增殖、凋亡有關，而且在腫瘤的生長、對化療的反應方面都扮演著重要角色［13］。特異性抑制 PI3K/Akt/mTOR通路的活性可減少腫瘤細胞的化療耐藥性，可增強化療效果，因此，PI3K/Akt/mTOR通路可作為腫瘤治療的潛在靶點［14，15］。我們的研究發現，阿霉素可以明顯抑制p－Akt的蛋白表達，而雷帕霉素可以顯著降低mTOR的蛋白水平，兩者合用后整個PI3K/Akt/mTOR通路的蛋白表達都下調，凋亡蛋白活化的caspase－3表達明顯增強。阿霉素與雷帕霉素分別作用于信號通路的不同環節，充分抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，可能是兩藥合用產生協同作用的機制。

綜上所述，雷帕霉素與阿霉素聯合使用能夠降低阿霉素在子宮內膜癌細胞中的使用劑量，協同增加子宮內膜癌細胞對阿霉素的敏感性從而降低腫瘤細胞對藥物的耐藥性，為提高阿霉素在臨床的療效提供了一個很好方案。

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