寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的研究*

李 嫻， 雷 娜， 段小花， 吳盛友， 李秀芳， 林 青

(云南中醫學院藥理教研室，云南 昆明 650500)

流行病學研究提示，急性上呼吸道感染(acute upper respiratory infections，AURI)在一年四季均有發生，但冬季較為多發，究其原因，一方面，機體受到寒冷刺激，致使呼吸道毛細血管阻力增高，滲透性降低，分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)明顯減少［1］，溶菌酶的活力降低;另一方面，由于冬季干燥，鼻黏膜容易發生細小的破裂，易導致細菌、病毒等入侵［2］。

黏膜免疫系統分布于人體的呼吸道、消化道等處，是機體防止細菌、病毒等病原微生物進入人體的第一道防線，研究顯示［3］，呼吸道黏膜免疫功能低下與AURI反復發作有關。發生AURI時，在病原微生物的刺激下，激活局部黏膜免疫應答，促使SIgA的合成與分泌增加，SIgA可通過中和病毒，以及抑制病原體與黏膜上皮細胞的接觸，同時可與溶菌酶、補體共同作用，引起細菌溶解［4］，從而發揮上呼吸道黏膜的保護作用。呼吸道局部SIgA含量及溶菌酶的活力降低是AURI發生的重要條件，并可導致上呼吸道感染遷延不愈，進一步發展為支氣管炎、肺炎乃至更嚴重的全身感染［5］。當氣溫下降時，鼻腔局部溫度降低到32℃左右，適合細菌和病毒的繁衍生長，也為病原體入侵提供了有利條件［6］，當這些細菌、病毒感染上呼吸道后，人體產生的免疫力較弱且短暫［7］，反復上呼吸道感染患者的細胞免疫功能受損，如果不加干預，其免疫功能會因反復感染進一步下降［8］，逐步導致AURI及其它并發癥的發生。由此可見，寒冷刺激與上呼吸道黏膜免疫功能低下的發生密切相關。而關于復制上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的方法，就作者所查文獻，未見相關報道。因此，建立黏膜免疫低下模型具有重要的理論和現實意義，于是，我們展開了相關研究。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 昆明種健康小鼠，雌雄各半，清潔級，體重18－22 g，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證號為SCXK(川)2004－16，批號為 Dossy2010－05。

1.2 藥品與試劑 硝酸毛果蕓香堿注射液，規格:1 mL∶2 mg，批號為1002081(天津金耀氨基酸有限公司);小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA試劑盒，規格:96 T，批號為QRCT－3013321021102EIAUTL(ADL公司);溶菌酶測試盒，規格:30 T，批號為20100526(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器 紫外分光光度計UV－2550(日本島津公司);DNM－9602G酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)。

2 方法

2.1 觀察小鼠置于－20℃寒冷環境中不同時段的生存狀況及唾液分泌情況 按參考文獻［9，10］，將小鼠隨機分為5組，即對照組、模型1組和模型2組、模型3組和模型4組，每組10只，雌雄各半。除對照組外，將其余4組小鼠分別放入－20℃寒冷環境中5 min(模型1組)、10 min(模型2組)、15 min(模型3組)和20 min(模型4組)，觀察小鼠生存狀況及小鼠唾液分泌情況。

2.2 觀察小鼠置于－20℃寒冷環境中不同時段唾液中SIgA含量及溶菌酶活性的變化 將小鼠隨機分為4組，即對照組、模型1組、模型2組和模型3組，每組10只，雌雄各半。除對照組外，將模型1－3組小鼠分別放入－20℃寒冷環境中5 min(模型1組)、10 min(模型2組)和15 min(模型3組)，寒冷刺激后在室溫下適應60 min，每只腹腔注射0.1%毛果蕓香堿注射液，2 min后用移液槍取小鼠唾液于Eppendorf管中，－40℃保存。采用雙抗體夾心法測定小鼠唾液中SIgA含量，并采用自身對照法測定溶菌酶活性。

3 統計學處理

結 果

1 小鼠置于－20℃寒冷環境中不同時段的生存狀況及唾液分泌情況

實驗結果顯示，模型4組中有50%的小鼠出現死亡，其余小鼠蜷縮顫抖，狀態不佳，唾液分泌量較少，無法滿足后期唾液中SIgA和溶菌酶活性檢測的需要，故不宜作為研究模型使用。模型1組小鼠出現蜷縮，偶爾小范圍爬動;模型2組小鼠蜷縮，出現扎堆現象，較少有爬動;模型3組小鼠蜷縮顫抖、扎堆，無爬動。由于模型3組的寒冷刺激時間較長，小鼠受涼較久，唾液分泌量恢復至正常較慢，故將其置于室溫中，收集并測定 15 min、30 min、45 min、60 min 小鼠唾液分泌量，而其它各組受涼時間較該組短，因此以該組恢復時間為準。結果表明60 min時模型小鼠唾液開始正常分泌，與對照組比較無顯著差異，較易取得實驗用唾液，因此以模型3組小鼠置于室溫中60 min時作為唾液收集最佳時間，見表1。

表1 寒冷刺激后模型3組小鼠在室溫中各時段的唾液分泌情況Table 1.The content of saliva secretion of mice of different room－temperature periods in the third model group after 15 min cold stimulation(.n=10)

表1 寒冷刺激后模型3組小鼠在室溫中各時段的唾液分泌情況Table 1.The content of saliva secretion of mice of different room－temperature periods in the third model group after 15 min cold stimulation(.n=10)

▲▲P ＜0.01 vs control group.

)Control － 203.33 ±31.41 Model 3 15 73.33 ±17.51▲▲30 105.00 ±18.71▲▲45 141.67 ±14.72▲▲60 198.33 ±23.17

2 小鼠置于－20℃寒冷環境中不同時段唾液中SIgA含量及溶菌酶活性的情況

結果顯示，模型3組小鼠與對照組比較，SIgA含量較低(P＜0.05)，溶菌酶活性也顯著低于對照組(P ＜0.01)，差異顯著;模型2組溶菌酶活性低于對照組(P＜0.05)，而SIgA含量與對照組比較，有降低趨勢而無顯著差異(P＞0.05);模型1組各項指標與對照組比較，均無顯著差異(P＞0.05)。以上結果提示，對小鼠進行15 min的－20℃寒冷刺激能降低小鼠唾液中SIgA含量及溶菌酶活性，見表2。

表2 寒冷刺激對小鼠唾液中SIgA含量和溶菌酶的影響Table 2.Effect of cold stimulation on SIgA content and lysozyme activity in saliva of mice(.n=10)

表2 寒冷刺激對小鼠唾液中SIgA含量和溶菌酶的影響Table 2.Effect of cold stimulation on SIgA content and lysozyme activity in saliva of mice(.n=10)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control group.

Group SIgA(g/L) Lysozyme(103U/L)Control 7.23 ±1.99 62.90 ±12.58 Model 1(5 min) 6.75 ±2.28 54.63 ±12.97 Model 2(10 min) 5.59 ±2.49 47.32 ±18.81▲Model 3(15 min) 5.21 ±1.50▲ 40.13 ±13.54▲▲

討 論

AURI是指各種病原引起的上呼吸道急性炎癥，臨床主要包括普通感冒、流行性感冒、病毒性咽炎、喉炎、支氣管炎、皰疹性咽峽炎、細菌性咽－扁桃體炎等疾病，典型癥狀為發熱、鼻塞、咽喉腫痛［1］。老年人、小兒、先天體弱者和病后體虛者等免疫力低下人群，患AURI的幾率較正常人大，且病情反反復復，不易痊愈。世界衛生組織已證實，免疫力低下是反復罹患AURI的根本原因［11］，而目前的治療措施尚難于從根本上治療AURI。以流行性感冒(簡稱流感)為例，是目前人類還不能有效控制的世界性傳染病，而決定流感流行的基本因素是流感病毒抗原變異與人群免疫狀態。近年來的研究表明，流感病毒的表面抗原不斷發生變異，所以在世界各地都有不同程度的暴發和流行［12］。呼吸道為開放性器官，與包括過敏原和生物毒素在內的外界環境保持連續不斷的接觸，而如今大氣污染嚴重，大氣中有害物質的濃度日益升高，因此對呼吸道黏膜的危害也越來越大，甚至導致黏膜上皮纖毛脫落和纖毛清除功能下降［13］，從而使上呼吸道局部黏膜免疫功能降低，以至人體免疫力下降，使很多人處于亞健康狀態［14］。2003年初發生的非典型肺炎以及近年來的甲型流感，其蔓延速度和較高的感染率、死亡率重新引起人們對呼吸道感染疾病的高度重視。目前，臨床上治療AURI大多從解除癥狀著手，普遍采用退熱、消炎等手段，以使用抗生素和解熱鎮痛藥對癥處理為主，未能從根本解決問題。如能通過增強機體黏膜免疫力，從而增強機體自身的抗病能力，是防治AURI的有效途徑之一。因此從黏膜免疫研究出發，展開對AURI的防治和藥物研究無疑具有重要的理論價值及臨床意義。

SIgA是黏膜免疫系統的主要效應分子，在呼吸道黏膜局部免疫中起重要防御作用，有效地防止呼吸道疾病的發生。Hewson－Bower等［15］研究發現呼吸道黏膜中較低的SIgA濃度會增加機體對AURI的易感性，高濃度的SIgA水平與上呼吸道抗感染能力直接相關。而溶菌酶為體液中的非特異性殺菌物質，由成熟的單核細胞和中性粒細胞釋放，在多種組織、黏膜分泌液中都含有溶菌酶，測定它在體液或分泌物中的活性可作為了解機體防御功能的一個重要指標［16］。因此，該研究選用唾液中的SIgA含量及溶菌酶活性作為反映動物呼吸道黏膜免疫功能的關鍵性指標進行相關研究。

該研究根據人體受涼后會引起局部黏膜免疫下降的事實及易發生AURI的現象，選擇－20℃作為寒冷刺激的溫度，探討建立了動物寒冷刺激后呼吸道黏膜免疫功能低下模型。結果顯示，小鼠置于－20℃寒冷環境中刺激20 min會引起大量動物死亡，可能是由于寒冷刺激時間過長，導致動物凍死，因此放棄該時間段。小鼠置于－20℃寒冷環境中刺激15 min，能使小鼠唾液中SIgA含量和溶菌酶活性明顯低于空白對照組小鼠，成功建立寒冷刺激致黏膜免疫功能低下小鼠模型。在該研究中還發現，寒冷刺激后小鼠應進行60 min室溫恢復，期間自由飲水，才能使模型小鼠的唾液分泌狀況與正常組小鼠無顯著差異，為取唾液的最佳狀態。

該研究所建立的寒冷刺激致黏膜免疫功能低下小鼠模型，造價低廉，造模時間短，成功率高，可滿足一般呼吸道黏膜免疫低下藥物藥效學研究需要，值得在相關研究中推廣。

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