高游離脂肪酸通過FOXO1途徑抑制內皮祖細胞增殖并促進其凋亡*

陳 莉， 王紅祥， 趙 湜， 李 娜， 張文靜， 丁 勝

(武漢市中心醫院內分泌科，湖北 武漢 430014)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝綜合征。血管并發癥是糖尿病的主要并發癥之一，嚴重影響了糖尿病患者的生活質量，其發生與血管內皮細胞及其前體細胞內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)相關。高游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)作為糖尿病血管并發癥發生中的重要環節，對血管內皮細胞的作用已經有較多研究，但其對EPCs的影響及其機制均不清楚。為此，本研究將FFA作用于EPCs，觀察其增殖及凋亡的變化，并檢測核轉錄因子叉頭框O1(forkhead box O1，FOXO1)蛋白的表達，以進一步了解糖尿病血管并發癥中FFA所起的作用，為其防治提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

M199培養基和胎牛血清購自Gibco。牛血清白蛋白(bouvine serum albumin，BSA)和疊氮化鈉購自Sigma。25 cm2培養瓶及各種培養板、離心管均購自Corning。MTT購自華美生物工程公司。胰蛋白酶購自上海生工生物工程公司。淋巴細胞分離液購自上海生化試劑二廠(比重1.077)。人纖維連接蛋白(human fibronectin，HFN)購自Chemicon。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自Peprotech。FITC標記抗CD34抗體和抗CD133抗體購自BD。Trizol購自Invitrogen，cDNA第1鏈合成試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTP購自Fermentas。引物由北京奧科公司合成。

2 對象與分組

32例2型糖尿病患者(DM組)均符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標準，男21例，女11例，平均年齡(45.1±11.7)歲，體重指數(26.3±12.5)kg/m2，糖尿病病程平均(14.8±8.4)年，糖化血紅蛋白(8.2% ±2.5%)，其中吸煙13例。對照組20例為來院體檢的健康人，男14例，女6例，平均年齡(44.4±10.2)歲，體重指數(24.2±8.7)kg/m2。2組年齡和體重指數經 t檢驗，差異無顯著(P＞0.05)。2組均排除了各種感染、潰瘍或近期手術等可能影響EPCs和導致周圍血管并發癥的情況［1］。

3 FFA的配制

取棕櫚酸，用乙醇配制成100 mmol/L的濃度;取牛血清白蛋白，用蒸餾水配制成10%BSA溶液;取50 μL 100 mmol/L棕櫚酸溶液，加入上述10%BSA溶液中，在55℃水浴中靜置15 min，直至溶液澄清，－20℃保存。臨用前在55℃水浴放置至澄清。

4 EPCs的培養

EPCs的培養及鑒定參照文獻［2］。簡述如下。取空腹外周靜脈血15 mL，常規密度梯度離心法獲取單個核細胞，并懸浮于5 mL M199培養基(含20%胎牛血清、VEGF 10 μg/L、bFGF 2 μg/L、EGF 5 μg/L、青霉素1×105μ/L、鏈霉素100 mg/L)中，將其鋪在纖維連接蛋白包被20 min的培養瓶內，37℃、飽和濕度、5%CO2溫箱中培養4 d。然后以M199培養基輕輕洗去未貼壁細胞，繼續以上述完全培養基培養至第7 d。將DiI－acLDL(2.4 mg/L)加入EPCs培養體系中，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，加入FITC標記的UEA－I(10 mg/L)，37℃繼續孵育1 h。4%多聚甲醛固定10 min后于熒光顯微鏡下觀察。FITC－UEA－I和DiI－acLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs。

5 EPCs增殖能力檢測

分別收集對照組和糖尿病組的EPCs，調整細胞濃度后將等量EPCs接種到包被有HFN的96孔培養板中，加入 FFA，使其濃度分別為 0、10和50 mmol/L。以絲裂霉素C處理30min的相同來源的EPCs作為對照，培養20 h，然后每孔加 10 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h后吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，選擇490 nm 波長，在自動酶聯檢測儀上測定各孔的吸光度(absorbance，A)值，并計算增殖率。增殖率(%)=(A實驗/A對照－1)×100%

6 EPCs凋亡的檢測

分別收集對照組和糖尿病組EPCs，與不同濃度FFA共培養48 h后，用PBS充分洗滌，胰酶消化后分別加入FITC標記的Annexin－V和PI溶液(操作按說明書進行)，流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件進行數據分析。Annexin－V陽性同時PI陰性的細胞計為早期凋亡細胞，將AnnexinV和PI均為陽性的細胞計為晚期凋亡細胞。計算細胞凋亡率。

7 RT－PCR法檢測FOXO1 mRNA表達

Trizol一步法提取EPC總RNA，操作按說明書進行。紫外分光光度儀測定RNA的A260/A280值。逆轉錄反應體系為20 μL，其中5×逆轉錄緩沖液4 μL，核糖核酸酶抑制劑 1 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，寡聚 T引物1 μL，細胞總 RNA 2 μL，M － MLV(逆轉錄酶)1 μL，用焦碳酸二乙酯(DEPC)三蒸水補充至 20 μL。反應條件為42℃ 1 h，然后70℃10 min以滅活逆轉錄酶。引物參照GenBank庫中的cDNA序列進行設計。FOXO1:上游引物5＇－ GCAACGCGTGGGGCAACCTGT－3＇，下游引物 5＇－ GGGCACGCTCTTCACCATCCACTC－3＇，擴增片段 116 bp。β － actin:上游引物 5＇－ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA －3＇，下游引物5＇－ CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC －3＇，擴增片段 540 bp。反應體系25 μL，其中 10 × PCR 緩沖液 2.5 μL，cDNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL(1 U)，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.2 μmol/L FOXO1 及 β －actin 上游及下游引物各1 μL，25 μmol/L MgCl2溶液2 μL。擴增條件:首次94℃預變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃1 min，循環33次，最后72℃ 10 min。取擴增產物5 μL，用 2%的瓊脂糖凝膠(溴化乙啶濃度為0.5 mg/L)電泳，100 bp DNA為分子量標準，在300 nm紫外光下攝影。

8 Western blotting法檢測FOXO1蛋白表達

應用TriPure提取蛋白法提取DM組和對照組EPCs蛋白，定量為2 g/L，每泳道點樣20 μg提取蛋白，經10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h，轉膜，經脫脂奶粉封閉后，分別加入小鼠抗人FOXO1單克隆抗體(1∶100)和小鼠抗人 β －actin抗體(1∶2000)，4℃孵育過夜，再加入兔抗小鼠IgG(1∶5000)孵育1 h，最后經ECL系統曝光顯影，通過凝膠分析系統分析蛋白的表達。

9 統計學處理

采用SAS 8.1 for Windows統計軟件進行數據處理。數據以均數±標準差()表示，多組間均數比較用One－way ANOVA分析。

結 果

1 EPCs增殖率的檢測

與未加FFA組相比，隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組EPCs增殖率均明顯下降，差異顯著(P＜0.05)。而相同FFA濃度下，DM組增殖率低于對照組(P ＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs增殖率的影響Table 1.Proliferative rate of EPCs treated with various concentrations of FFA in diabetes mellitus(DM)group and control group(%.)

表1 不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs增殖率的影響Table 1.Proliferative rate of EPCs treated with various concentrations of FFA in diabetes mellitus(DM)group and control group(%.)

＊＊P ＜0.01 vs FFA 0 mmol/L;△△P ＜0.01 vs control.

Group FFA(mmol/L)n 10 50 Control 20 17.8 ±3.2 14.3 ±3.7＊＊ 9.4 ±2.60＊＊DM 32 15.2 ±3.1 10.4 ±3.5＊＊△△ 5.5 ±2.4＊＊△△

2 EPCs凋亡的檢測

隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組EPCs早期和晚期凋亡率均增加，差異顯著(P＜0.05)。而相同FFA濃度下，DM組早期和晚期凋亡率亦高于對照組，差異顯著(P＜0.05)，見表2。

表2 不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs凋亡率的影響Table 2.Apoptotic rates of EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group(%.)

表2 不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs凋亡率的影響Table 2.Apoptotic rates of EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group(%.)

＊＊P ＜0.01 vs FFA 0 mmol/L;△P ＜0.05 vs control.

Group n Apoptotic FFA(mmol/L)10 50 Control 20 Early 3.6 ±1.6 5.5 ±3.0＊＊ 11.3 ±6.1 type 0＊＊Late 4.7 ±2.4 6.3 ±3.6＊＊ 10.2 ±3.2＊＊DM 32 Early 4.1 ±2.0 6.5 ±2.8＊＊ 14.5 ±5.4＊＊△Late 3.2 ±1.1 8.8 ±3.4＊＊△ 12.3 ±5.0＊＊△

3 FOXO1的mRNA和蛋白表達

RT－PCR法檢測發現，隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組FOXO1的mRNA表達逐漸降低，差異顯著(P＜0.05)，見表3、圖1。Western blotting法檢測發現，隨著FFA濃度的增加，FOXO1蛋白表達逐漸下降，見表4、圖2。

表3 不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs中FOXO1 mRNA表達的影響Table 3.Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group()

表3 不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs中FOXO1 mRNA表達的影響Table 3.Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group()

＊＊P ＜0.01 vs FFA 0 mmol/L.

FFA(mmol/L)Group n 10 50 Control 20 0.90 ±0.11 0.65 ±0.09＊＊ 0.41 ±0.140＊＊DM 32 0.80 ±0.13 0.52 ±0.11＊＊ 0.31 ±0.20＊＊

Figure 1.Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA(Lane 1，4:0 mmol/L;Lane 2，5:10 mmol/L;Lane 3，6:50 mmol/L)in control group(Lane 1－3)and DM group(Lane 4－6).M:100 bp DNA marker from 100 to 600 bp.圖1 不同濃度的FFA對EPCs中FOXO1 mRNA表達的影響

表4 不同濃度的FFA對DM組EPCs中FOXO1蛋白表達的影響Table 4.Expression level of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group(.n=32)

表4 不同濃度的FFA對DM組EPCs中FOXO1蛋白表達的影響Table 4.Expression level of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group(.n=32)

*P ＜0.05 vs FFA 0 mmol/L.

FFA(mmol/L) FOXO1/β－actin 0.85 ±0.1710 0.47 ±0.15*50 0.22 ±0.120*

Figure 2.Expression of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group.圖2 不同濃度的FFA對DM組EPCs中FOXO1蛋白表達的影響

討 論

本研究將FFA作用于糖尿病患者EPCs，觀察對其增殖、凋亡的影響，結果發現，FFA可抑制EPCs增殖，促進其凋亡，且這些作用具有劑量依賴性。FFA是細胞膜脂質結構和前列腺素合成的供體，也是脂肪代謝的中間產物。許多研究表明高脂飲食誘導的胰島素抵抗在糖尿病的發生中起到重要作用［3］，但FFA與糖尿病周圍血管病的關系研究較少。而糖尿病周圍血管病作為糖尿病的一種慢性并發癥，其發生與EPCs關系密切［4］。本研究結果顯示，FFA可抑制EPCs的增殖，在糖尿病周圍血管病的發生發展中起到一定作用。

在脂肪和肌肉組織中，過氧化物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferator－ activated receptors，PPAR)家族和FOXO家族是維持血糖穩定和胰島素敏感性的2個關鍵轉錄因子家族［5］。FOXO轉錄因子位于細胞核內，在沒有胰島素存在情況下能夠促進細胞內葡萄糖合成關鍵酶的合成，而在胰島素的作用下，通過磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3 －kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)途徑，磷酸化后移出細胞核，阻斷其促進葡萄糖生成酶的作用，從而中止葡萄糖的合成［6］。FOXO轉錄因子還在氧化應激［7－9］和清除自由基方面發揮作用［10，11］，其下游基因包括保護細胞免受過氧化的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)等［12］。2 型糖尿病患者體內一般存在高FFA，這種狀態對糖尿病患者的心肌細胞功能可造成不良影響［13］，還有報道高FFA可抑制脂肪細胞表達FOXO1［14］，但對EPCs的作用尚未見報道。

為此，我們研究了在高FFA作用下EPCs表達FOXO1的情況，結果發現，隨著FFA濃度的增加，EPCs中FOXO1的表達逐漸減低。FFA增加，線粒體內游離自由基的合成也隨之增加，氧化應激增強;同時FOXO1表達減弱，下游清除自由基的分子如MnSOD合成減少，兩方面綜合作用，可能損害EPCs。還有研究發現，FOXO的功能與周圍血管功能密切相關。當缺乏FOXO時，血管內皮細胞失去了對VEGF的反應性［15］，且血管平滑肌細胞持續增殖，使血管壓力增高，從而導致血管內皮受損［16］。本研究結果還提示，高 FFA情況下，EPCs的凋亡也增加，因此FOXO表達減弱是由于EPCs凋亡增加引起，還是由于FFA的直接作用，尚待進一步探討。

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