RNAi沉默N－cadherin表達對EC9706細胞裸鼠移植瘤生長的影響*

李 克， 劉 鶯， 劉文靜， 侯新芳， 何素英， 王居峰

(河南省腫瘤醫院腫瘤科，河南 鄭州 450008)

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國特別是河南等省份是食管癌的高發地區［1，2］，其死亡率居惡性腫瘤的第4位。由于侵襲、轉移是引起食管癌患者死亡的主要原因，因此對食管癌侵襲轉移機制的探討已成為當前研究的熱點。

鈣黏附蛋白家族(cadherin family)與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，其中以上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)和神經型鈣黏附蛋白(N-cadherin)分布最廣泛。國內外已有研究表明，食管鱗狀細胞癌的侵襲、轉移與E-cadherin的低表達或不表達有關。最近研究表明，在前列腺癌和乳腺癌中N-cadherin表達增多，并且在引起腫瘤侵襲轉移方面有著比E-cadherin 減少更為重要的作用［3，4］。N-cadherin 對于腫瘤上皮細胞及表達 N-cadherin的血管平滑肌細胞和內皮細胞之間的黏附起著重要作用。在腫瘤形成過程中，N-cadherin的表達有助于血管形成及上皮細胞-間質細胞的遷移，從而使腫瘤細胞更加富于侵襲性，易于轉移［5］。此外，N-cadherin還是一種凋亡抑制因子，可以通過抑制凋亡而促進腫瘤細胞的生長和存活。如前文所述［6］，本研究首先通過對食管鱗狀細胞癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織中E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達及其與臨床病理諸因素的關系進行分析，發現人食管鱗狀細胞癌組織中E-cadherin的低表達和N-cadherin的高表達與食管鱗狀細胞癌的發生、發展及侵襲、轉移密切相關;然后又通過逆轉錄病毒介導的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，降低人食管鱗狀細胞癌細胞系EC9706細胞中N-cadherin mRNA和蛋白的表達水平，結果發現:RNAi沉默N-cadherin表達可以使EC9706細胞的體外侵襲力顯著降低，從而提示N-cadherin與食管鱗狀細胞癌細胞的侵襲、轉移密切相關，食管鱗狀細胞癌的侵襲、轉移可能是N-cadherin和MMP-9共同作用的結果。因此，本研究通過荷瘤裸鼠實驗，將RNA干擾前后的EC9706細胞通過皮下注射的方式接種于裸鼠體內，觀察各組裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤體重量及細胞凋亡的情況，檢測各組裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和 MMP-9的表達，從而為N-cadherin治療食管鱗狀細胞癌的可行性研究提供理論基礎。

材料和方法

1 材料

4-6周 BALB/c-nude裸鼠15只，雌性，平均體重16-18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。pEGFP-MSCVneo質粒和 pMSCVneo/N-cadherin質粒由協和醫科大學馬杰博士饋贈。pMSCVneo/N-cadherin質粒大小為7.5 kb，內含EGFP基因序列、U6啟動子序列和多克隆位點等。人食管癌細胞株EC9706由中科院提供;包裝細胞株PT67購自Clontech;E-cadherin、N-cadherin和 MMP-9Ⅰ抗(鼠抗人單克隆抗體)購自Abcam;脂質體Lipofectamine 2000TM購自Invitrogen;TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

2 方法

2.1 逆轉錄病毒介導的RNAi沉默N-cadherin基因在EC9706細胞中的表達

①脂質體法轉染病毒包裝細胞PT67及抗性克隆的篩選與擴增 將病毒包裝細胞PT67接種至6孔培養板中，待其融合達90%-95%時，用脂質體法對其進行轉染(具體方法見 LipofectamineTM2000說明書)。轉染共分4組:正常對照組﹑脂質體組和pEGFP-MSCVneo質粒組﹑pMSCVneo/N-cadherin質粒組。

選用G418進行抗性克隆的篩選和擴增，初選濃度為1000 mg/L(由預實驗得出)，10-15 d后降為300 mg/L，繼續維持10-15 d。轉染后的細胞每隔3-4 d在倒置熒光顯微鏡下488 nm波長處觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達情況。

②病毒滴度的測定 從pEGFP-MSCVneo質粒組、pMSCVneo/N-cadherin質粒組經G418篩選形成的PT67抗性克隆中，分別挑取2個邊界清楚的克隆進行擴增，收集病毒上清用以感染NIH3T3細胞，并用G418(600 mg/L)加壓篩選，用未感染的NIH3T3細胞作對照。2周后計算每瓶內的克隆數，按下式計算病毒滴度。病毒滴度(cfu/L)=克隆數/［病毒原液的體積(L)×復制因子×稀釋度］。選取病毒滴度最高的病毒上清進行后續實驗。

③EC9706細胞的轉染及抗性克隆的篩選與擴增將EC9706細胞接種至6孔培養板中，待其融合達90%-95%時，進行感染，感染共分3組:正常對照組﹑pEGFP-MSCVneo病毒上清組(空載體組)﹑pMSCVneo/N-cadherin病毒上清組(干擾載體組)，方法與病毒滴度測定相同，篩選出具有G418抗性的EC9706細胞克隆，并用含G418(300 mg/L)的條件培養基進行維持培養。

2.2 裸鼠異種腫瘤接種實驗

①EC9706細胞懸液的制備 大量擴增并收獲處于對數生長期的正常對照組、空載體組和干擾載體組EC9706細胞，用不含 Ca2+、Mg2+的 PBS液(0.01 mol/L，pH 8.0)洗滌2次并制備成1×1010cells/L的細胞懸液。

②動物準備及腫瘤細胞接種 將15只裸鼠隨機分為3組:正常對照組、空載體組和干擾載體組，每組各5只。將裸鼠常規消毒后，選取各組裸鼠背部肩胛旁區作為注射點，分別皮下注射3組EC9706細胞懸液(1 ×1010cells/L)，0.2 mL/只。

③生長曲線的繪制 定期觀察裸鼠成瘤情況，每隔7d測量移植瘤的長徑(L)和短徑(S)，根據公式V(cm3)=L×S2×0.5來計算移植瘤的近似體積，并繪制腫瘤生長曲線，計算成瘤率。

④瘤體終重量和終體積的比較 接種5周后，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝離瘤體，測量瘤體終體積，并稱取瘤重，以計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%;切除部分新鮮標本投入液氮中保存，以備Western blotting實驗所用;剩余腫瘤組織用40 g/L多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，用于HE染色、免疫組化及細胞凋亡的檢測。

2.3 裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達

①免疫組織化學法檢測裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達 將各組裸鼠移植瘤組織經40 g/L多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片，切片厚度4-6 μm。染色方法嚴格參照免疫組化PV-9000試劑盒說明書進行操作，以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。胞膜/胞質棕黃色染色為陽性，其中E-cadherin以胞膜著色為主，N-cadherin和MMP-9以胞質染色為主，每張切片隨機取5個視野(×400)，觀察200個細胞，計數陽性細胞。

②Western blotting檢測裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達 研缽常規消毒后，加入液氮，取約50 mg組織塊研磨，磨碎后加入適量(約200 μL)蛋白裂解液，繼續研磨至粉末，轉移至預冷的EP管中，待粉末溶化后，1500×g離心30 min，去上清轉移至一新的EP管中，即為組織蛋白。嚴格參照Western blotting試劑盒說明書進行操作，用β-actin抗體作為上樣對照。Western blotting結果的灰度值分析采用Gene Tools軟件完成。

2.4 凋亡的原位酶標記檢測(TUNEL法) 將石蠟包埋的組織切片預處理后，嚴格參照TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書進行染色，同時設陰性及陽性對照。以背景無顏色，細胞核內著棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機取5個視野(×400)，觀察200個細胞，計數陽性細胞。

3 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，數據以均數±標準差()表示，多個樣本均數比較應用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

結 果

1 逆轉錄病毒介導的RNAi沉默N－cadherin基因在EC9706細胞中的表達

1.1 脂質體法轉染病毒包裝細胞PT67及陽性克隆的篩選與擴增 轉染24 h后在熒光顯微鏡下488 nm波長處觀察，pEGFP-MSCVneo質粒組、pMSCVneo/N-cadherin質粒組PT67細胞均可見明亮的綠色熒光，胞漿和胞核都有，正常對照組、脂質體組未見綠色熒光。20-30 d后正常對照組、脂質體組細胞全部死亡，從而得到穩定轉染的PT67細胞。

1.2 病毒滴度的測定 pEGFP-MSCVneo質粒組PT67細胞克隆1和2的病毒滴度分別為6×107cfu/L和 1×107cfu/L，pMSCVneo/N-cadherin質粒組PT67細胞克隆1和2的病毒滴度分別為2×107cfu/L和8×107cfu/L，遂選擇pEGFP-MSCVneo質粒組PT67細胞克隆1和pMSCVneo/N-cadherin質粒組PT67細胞克隆2的病毒上清對EC9706進行轉染。

1.3 EC9706的轉染及抗性克隆的篩選與擴增 將病毒上清轉染EC970624 h后，空載體組及干擾載體組即可見綠色熒光，胞漿和胞核都有，而正常對照組未見綠色熒光。當G418以600 mg/L的初選濃度作用5-7 d后，正常對照組細胞絕大部分死亡，然后將G418濃度降為300 mg/L維持，10-15 d后正常對照組細胞全部死亡，而空載體組及干擾載體組則形成大小不一的抗性克隆，后續培養中仍用含300 mg/L G418的條件培養基維持。

2 荷瘤裸鼠異種腫瘤接種實驗

2.1 人食管鱗狀細胞癌細胞系EC9706細胞異種移植瘤動物模型的建立 正常對照組、空載體組裸鼠均于接種后第7-8 d左右的時間出現肉眼可見的瘤體，而干擾載體組裸鼠出瘤時間較前2組延長大2-4 d。瘤體起初為橢圓形，以后生長漸不規則，凸凹不平。接種5周后，處死裸鼠并迅速測量瘤體體積和重量，見圖1。與正常對照組、空載體組相比，干擾載體組裸鼠移植瘤體積和重量均明顯減小，差異顯著(P＜0.05)。空載體組的腫瘤抑制率為6.89%，而干擾載體組的腫瘤抑制率為79.52%。解剖學檢查各組沒有明顯差別，瘤體有完整包膜，未見腫瘤向周圍組織侵襲，全身未見腫瘤轉移，淋巴結不易找到，無胸腺，肺臟無栓塞。心、肝、脾、腎等器官肉眼觀察無異常。

Figure 1.Effect of N－cadherin knock-down on EC9706 tumor growth in nude mice.A:photograph of nude mice at the 5th week;B:photograph of tumor tissues in nude mice at the 5th week;C:down-regulation of N-cadherin reduced the volumes of tumor tissues in N-cadherin RNAi group at the 5th week;D:down-regulation of N-cadherin reduced the weights of tumor tissues in N-cadherin RNAi group at the 5th week..n=5.*P＜0.05 vs untreated and control vector groups.圖1 RNA干擾沉默N－cadherin表達對EC9706細胞裸鼠體內成瘤能力的影響

2.2 生長曲線的繪制 接種后定期觀察各組裸鼠移植瘤生長情況，每7 d測量1次裸鼠瘤體體積，然后繪制其生長曲線，結果顯示:干擾載體組裸鼠瘤體生長緩慢且瘤體體積顯著小于正常對照組和空載體組，組間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The grouth curves of tumor tissues in the 3 groups of nude mice..n=5.＊＊P＜0.01 vs untreated and control vector groups.圖2 3組裸鼠移植瘤體積生長曲線

2.3 裸鼠移植瘤的組織學觀察 3組裸鼠移植瘤組織HE染色后，光鏡下觀察可見大小不等的瘤細胞團，其中散在灶狀、片狀凝固性壞死，瘤細胞多為圓形或多角形上皮樣細胞，大小不一，排列緊密，核染色質致密，染色深，異型性明顯，部分腫瘤細胞病理性核分裂像可見。瘤細胞團周圍有少量纖維結締組織包繞，未見色素顆粒，見圖3。

3 3 組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9蛋白的表達

3.1 免疫組織化學法檢測各組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達 3組裸鼠移植瘤組織均見到E-cadherin蛋白陽性染色，呈棕黃色顆粒，陽性信號定位于細胞膜，3組比較差異無顯著(P＞0.05);正常對照組和空載體組裸鼠腫瘤組織中可見到N-cadherin和MMP-9蛋白陽性染色，呈棕黃色顆粒，陽性信號定位于細胞質，而干擾載體組中N-cadherin和MMP-9蛋白的陽性染色較弱，與正常對照組和空載體組比較，差異均顯著(P ＜0.05)，見表1、圖4。

3.2 Western blotting檢測3組裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達 正常對照組、空載體組和干擾載體組3組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin的蛋白表達比較，無顯著差異(P＞0.05);正常對照組和空載體組2組裸鼠腫瘤組織中N-cadherin的蛋白表達相比無明顯變化(P＞0.05)，而干擾載體組中N-cadherin的蛋白表達與以上2組相比則明顯降低(P＜0.05);正常對照組和空載體組2組裸鼠腫瘤組織中MMP-9的蛋白表達相比無明顯變化(P＞0.05)，而干擾載體組中MMP-9的蛋白表達與以上2組相比則明顯降低(P＜0.05)，見圖5。

Figure 3.HE staining of tumor tissue in the 3 groups of nude mice(×400).圖3 3組裸鼠移植瘤組織的HE染色結果

表1 3組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9蛋白表達的比較Table 1.Comparision of E-cadherin，N-cadherin and MMP-9 protein expression in the 3 groups of nude mice

Figure 4.Expression of E-cadherin，N-cadherin and MMP-9 proteins in the 3 groups of nude mice(×400).圖4 3組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9蛋白的表達

Figure 5.Western blotting analysis for N-cadherin，E-cadherin and MMP-9 expression in nude mice.1:untreated group;2:control vector group;3:N-cadherin RNAi group..n=5.*P＜0.05 vs untreated and control vector groups.圖5 3組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9的蛋白表達

4 裸鼠移植瘤組織中細胞凋亡的檢測

凋亡的原位酶標記檢測結果顯示，凋亡細胞的細胞核內出現棕黃色顆粒，干擾載體組凋亡的陽性細胞數明顯增加，與正常對照組和空載體組相比差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.Apoptosis analysis of tumor tissues in the 3 groups of nude mice(TUNEL，×200)..n=5.*P＜0.05 vs untreated and control vector groups.圖6 3組裸鼠移植瘤組織中細胞凋亡情況

討 論

E-cadherin和N-cadherin不僅在介導鈣離子依賴的同型細胞間的黏附中發揮作用，而且在細胞遷移和腫瘤侵襲轉移方面也有著重要作用。許多研究表明，E-cadherin是作為一種抑癌基因發揮作用的［7］。而最近研究表明，和 E-cadherin相反，N-cadherin在促進腫瘤的侵襲轉移方面具有重要作用。

為了研究RNAi沉默N－cadherin表達對人食管鱗狀細胞癌EC9706細胞體內生物學行為的影響，我們將轉染前后的EC9706細胞大量擴增、收集后分別種植于裸鼠皮下，成功建立EC9706細胞異種移植瘤動物模型，該模型為進一步研究N-cadherin與食管鱗狀細胞癌發生、發展及侵襲、轉移關系奠定了良好基礎。接種5周后，處死裸鼠并分離瘤體，分別行3組裸鼠移植瘤體積和重量的組間比較，結果發現:正常對照組、空載體組相比無顯著差異(P＞0.05)，而干擾載體組與以上2組相比，組間比較差異顯著(P＜0.05)。這提示，RNAi沉默 N－cadherin表達對EC9706細胞裸鼠皮下移植瘤的生長有顯著抑制作用。

本研究聯合運用免疫組織化學法和Western blotting方法比較了3組裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達情況，結果顯示:3組裸鼠皮下移植瘤中E-cadherin蛋白的表達無顯著差異;而與正常對照組和空載體組相比，干擾載體組N-cadherin和MMP-9蛋白的表達明顯減弱。這提示，干擾載體組EC9706細胞移植于裸鼠體內后，N-cadherin和MMP-9蛋白仍維持低表達，RNA干擾沉默N－cadherin表達可能通過下調MMP-9的表達，降低細胞對細胞外基質的降解能力，進而降低EC9706細胞的體內侵襲力。

已有多項體外實驗表明［8-10］，N-cadherin的異常高表達可以抑制腫瘤細胞凋亡。Li等［11］發現，黑色素瘤細胞中N-cadherin介導的細胞間黏附可以激活Akt/PKB通路，而導致預凋亡蛋白Bad失活和穩定態β-catenin的聚集，最終促進癌細胞的存活。Tran 等［12］發現，在前列腺腫瘤中，N-cadherin/catenin黏著復合體可以通過一個信號轉導級聯反應上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，進而增加轉移過程中癌細胞的生存能力。Makrigiannakis等［13］發現，抑制N-cadherin功能的抗N-cadherin抗體可以誘導表達N-cadherin的卵巢顆粒細胞發生凋亡。Gwak等［14］發現，通過反義載體轉染抑制N-cadherin的功能后，與對照組相比，肝癌細胞在膽汁酸作用下更容易發生凋亡。Jiang等［15］發現，表達TIP30腫瘤抑制因子突變型(可以保護細胞抵抗順鉑誘導的凋亡)的人肝癌細胞HepG2對化療不敏感，但如果運用RNA干擾技術沉默N－cadherin的表達，這類細胞又重新獲得了對順鉑的敏感性。以上研究結果均表明，N－cadherin是一種凋亡抑制因子，可以通過抑制凋亡而促進腫瘤細胞的生長和存活。本實驗運用TUNEL法比較了3組裸鼠移植瘤組織中細胞的凋亡情況，結果顯示:干擾載體組裸鼠移植瘤組織中凋亡的陽性細胞數明顯增加。這提示，RNAi沉默N－cadherin表達可能通過誘導細胞凋亡，進而抑制EC9706細胞裸鼠皮下移植瘤的生長。

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