尼古丁抑制穿孔素/顆粒酶 B誘導的A549肺癌細胞凋亡*

曾 芳， 黎運呈， 王曄愷， 劉曉光△

(1舟山醫院中科院免疫基因組學聯合實驗室，2舟山醫院傳染科，浙江 舟山 316004)

肺癌的發病率和死亡率在全球范圍內均居首位。在美國等發達國家肺癌的死亡率已經超過其它常見惡性腫瘤死亡的總和［1］。吸煙是其發病的一個主要危險因子，而尼古丁是煙草的主要成分。早先的報道稱尼古丁可能具有遺傳毒性，和DNA、組蛋白H1/H3或H1b形成加合物，而引起關鍵基因的突變，導致腫瘤形成［2，3］。現在也有證據表明尼古丁能導致有絲分裂原途徑的持續活化，促進血管生成、腫瘤生長和動脈粥樣硬化［4－8］。另外，尼古丁也可抑制由抗癌藥依托泊苷(etoposide，VP－16)和順鉑(cisplatin，DDP)以及紫外線誘導的肺癌細胞凋亡［9－11］。效應細胞毒性 T 淋巴細胞(cytotoxic T －lymphocyte，CTL)對靶細胞實行殺傷的途徑主要有2條:FasL－Fas介導的細胞凋亡作用和通過顆粒胞吐分泌穿孔素、顆粒酶介導的溶細胞作用。Kontani等［12］通過免疫組織化學的方法研究表明，肺癌患者有100%和54%的人顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)陽性，有趣的是它們不是表達在腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor－infiltrating lymphocyte，TIL)中而是在腫瘤細胞中。Xu等［13］對CTL殺傷腫瘤細胞的機制研究表明，CTL殺傷腫瘤細胞時主要通過釋放穿孔素/顆粒酶的細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，而不是Fas/FasL介導的凋亡程序，這說明機體的TIL和自然殺傷細胞等免疫活性細胞已經對腫瘤作出了相應的反應。然而尼古丁是否會抑制由perforin/granzyme B介導的肺癌細胞凋亡作用，目前尚未闡明。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 RPMI－1640培養基和小牛血清購自Gibco。異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V(Annexin V －fluorescein 5－isothiocyanate，Annexin V －FITC)和碘化丙啶(propidine iodide，PI)雙染凋亡試劑購自BD。吖啶橙/溴乙啶(acridine orange/ethidium bromide，AO/EB)和3－(4，5－二甲基噻唑 －2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2 －yl)－2，5 －diphenyltetrazolium bromide，MTT］染色劑購自碧云天生物技術有限公司。RTPCR試劑盒購自Promega。PCR引物均由上海生工合成。尼古丁購自Wako Pure Chemical Industries。Perforin和granzyme B均購自Alexis。其它化學試劑購自國藥，均為AR級。

1.2 細胞培養 A549肺癌細胞購自中國科學院上海細胞庫。采用RPMI－1640培養基和10%小牛血清作為基礎培養基，添加1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，在37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養箱中培養。

2 方法

2.1 Perforin濃度的確立 Perforin在誘導細胞凋亡前應確立穿透靶細胞的最低濃度。按照試劑說明書將1 μg perforin溶解到1 mL perforin稀釋液中，配成母液濃度是1 mg/L。用1%BSA－HEPES buffer(BSA溶解于不含Ca2+的HEPES緩沖液配成1%的濃度)50 μL梯度稀釋perforin成終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/L 的 perforin組。收集細胞并計數，調整細胞密度為1×106cells/組。用Ca2+－HEPES buffer(20 mmol/L HEPES含150 mmol/L NaCl和 2.5 mmol/L CaCl2，pH 7.4)洗細胞2次，將不同濃度的perforin加到各組細胞中，37°C時共孵育15 min，采用碘化丙啶(PI)染色法確定穿透性達到最大時的最小perforin濃度，染核率=PI染色陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.2 Granzyme B濃度的確立及聯合perforin觸發凋亡的檢測 收集細胞，調整細胞密度為1×106cells/組。采用Ca2+－HEPES buffer清洗細胞2次，加入上述確定的perforin濃度，使細胞數與確定的perforin濃度劑量比例是1×106cells/50 μL，再加入0.5、1、1.5、2 μL 等不同劑量 granzyme B(1 mg/L)，混勻后滴到48孔板爬片上繼續培養，孵育4－6 h后采用AO/EB染色后熒光顯微鏡下觀察細胞形態，并采用Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡細胞數。

2.3 細胞生長抑制率曲線 采用MTT比色法檢測不同濃度尼古丁(1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)作用A549細胞時的生長抑制率。以5×103cells/well的密度將對數生長期細胞種到96孔板中。孵育24 h后，采用尼古丁不同濃度組作用細胞6、12 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L溶解于PBS)。孵育4 h，吸棄MTT，加150 μL DMSO，37℃孵育10 min直到結晶全部溶解。用680型酶標儀在490 nm波長時檢測吸光度值。抑制率公式為:A=［A(正常組)－A(藥物組)］/［A(正常組)－A(空白組)］×100%。細胞增殖被抑制50%時的吸光度抑制率為IC50。

2.4 瑞氏染色法 制作細胞爬片，瑞氏染液滴到爬片上，稍等1－2 min后，再緩慢地加入等量pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動玻片，染色10－20 min，用自來水緩緩沖洗至少3 min以上，吸干液體。光鏡下檢測細胞核染成紅色，細胞漿染成藍色。

2.5 細胞凋亡形態學改變及其定量檢測 單獨或者聯合應用尼古丁和perforin/granzyme B作用A549細胞6 h被檢測。細胞首先采用低血清培養基培養24 h以去除外源性生長因子。倒置顯微鏡下觀測細胞形態改變。收集貼壁和懸浮細胞，采用Annexin V和PI雙染法檢測其凋亡細胞數。細胞樣品采用冰冷PBS洗1次，在500×g、4℃離心5 min。棄上清，采用冰冷的PBS重懸細胞，使其密度為5×108至5×109cells/L。取出100 μL重懸液加入Annexin V－FITC溶液5 μL和PI溶液2.5 μL，吹打勻后避光孵育10 min。加冰冷400 μL 1×結合液到細胞樣品中，輕輕混勻上機檢測，結果采用CellQuest軟件分析。

2.6 RT－PCR分析 X連鎖凋亡抑制蛋白(X－linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)和存活素(survivin)mRNA的表達量 收集細胞計數，提取總RNA，采用AMV－RT kit(Promega)試劑盒抽提說明書進行 cDNA提取。采用一步法擴增 XIAP(368 bp)、survivin(290 bp)和β－actin(234 bp)cDNA片段，引物分別是:XIAP前向引物5＇－GTGACTAGATGTCCACAAGG －3＇，反向引物 5＇－ CTTGAGGAGTGTCTGGTAAG－3＇;survivin前向引物 5＇－CTTGAAAGTGGCACCAGAGG －3＇，反向引物 5＇－ TGCAGCTCAGATTCAACAGG－3＇;β －actin前向引物 5＇－ GGACTTCGAGCAAGAGATGG － 3＇，反向引物 5＇－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3＇。RT－PCR 的條件如下:45℃ 45 min;95℃ 10 min;95℃ 30 s，50℃(XIAP)、60℃ (Survivin)、56 ℃ (β －actin)退火30 s，72℃ 45 s，共35個循環;72℃ 10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀下拍照并采用Quantity One軟件分析數據。

3 統計學處理

用SPSS軟件包(15.0)分析數據，數據以均數±標準差()表示，實驗重復至少3次。采用單因素方差分析、直線相關與回歸分析進行統計學處理。

結 果

1 Perforin及granzyme B濃度的確立及其對A549細胞凋亡的誘導

用 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/L perforin作用1×106個A549細胞時，1、0.5、0.25 mg/L perforin 導致細胞全部死亡，PI染核率基本為100%。0.125 mg/L perforin細胞染核率為90%以上，而 0.0625、0.03125、0.015625 mg/L perforin隨著濃度的降低，PI染核率越低。故我們選擇0.125 mg/L濃度perforin作為最適合的濃度組去穿透細胞膜。當用0.5、1、1.5、2 μL granzyme B 作用1×106個細胞時，0.5 μL granzyme B 導致的凋亡率為60% 左右，而 1、1.5、2 μL granzyme B 均可導致90%以上的細胞凋亡率，見圖1。故我們選擇最低的1 μL granzyme B劑量作為作用終劑量。因此，perforin/granzyme B作用A549細胞(1×106)時的作用濃度及劑量分別為50 μL perforin(0.125 mg/L)和1 μL granzyme B(1 mg/L)。

Figure 1.The concentration of perforin or granzyme B was determined.A:fluorescence microscopy images showing the control group and the 50 μL perforin(1 mg/L)combined with 1 μL granzyme B(1 mg/L)group(AO/EB staining，×400);B:flow cytometry analysis showing the control group and the 50 μL perforin(1 mg/L)combined with 1 μL granzyme B(1 mg/L)group(Annexin V/PI staining).Mechanical injured cells are in the left upper quadrant(a zone，Annexin V－/PI+);middle and late apoptotic cells or necrotic cells are in the right upper quadrant(b zone，Annexin V+/PI+);early apoptotic cells are in the right lower quadrant(c zone，Annexin V+/Pl－);normal live cells are in the left lower quadrant(d zone，Annexin V－/PI－).圖1 Perforin及granzyme B濃度的確立

2 尼古丁抑制A549細胞增殖

MTI實驗表明，1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L尼古丁對A549細胞生長具有明顯抑制作用。隨著尼古丁濃度的增大，對細胞的生長抑制作用越明顯，并呈時間依賴性，見圖2A。我們采用Annexin V/PI法檢測凋亡率，瑞氏染色法檢測細胞形態學改變，發現采用不同濃度和時間時，尼古丁作用A549細胞均不會誘導明顯的凋亡現象(數據沒有顯示)，僅僅在高濃度時出現細胞數量明顯變少，體積變圓，胞漿產生大量透明空泡，見圖2B。于是我們推論由于尼古丁的細胞毒性作用導致細胞生長受到抑制，且尼古丁作用于 A549細胞6 h的半數抑制濃度 IC50是32 μmol/L。

Figure 2.A:linear inhibition curves of A549 cells after treated with nicotine(1，2，4，8，16，32，64 and 128 μmol/L)for 6 and 12 h(MTT assay);B:morphological changes of A549 cells after treated with nicotine(64 μmol/L)or none for 6 h(Wright＇s staining，×400).圖2 不同濃度的尼古丁作用于A549細胞6 h和12 h的細胞生長抑制率及64 μmol/L尼古丁作用于A549細胞6 h的細胞形態變化

3 尼古丁對perforin/granzyme B誘導的細胞凋亡的抑制作用

實驗分為正常組、尼古丁32 μmol/L組、perforin/granzyme B組和聯合組(尼古丁32 umol/L+perforin/granzyme B)共4組。尼古丁作用A549細胞6 h，觀察細胞的形態學改變。正常組細胞呈葉形，單層貼壁生長，折光性強;尼古丁32 μmol/L組細胞胞漿大量空泡化，細胞形態變圓;perforin/granzyme B組細胞凋亡改變明顯，可見細胞核質比減少，包膜皺縮，出泡，胞質呈放射狀分布;聯合組細胞胞漿可見輕微空泡化表現，折光性變差，凋亡現象不明顯，見圖3。我們采用流式細胞術檢測4組的凋亡率，結果perforin/granzyme B組凋亡率很高，可達到90%，這與圖1B的結果一致。正常組、尼古丁32 μmol/L組和聯合組未見明顯凋亡現象。

Figure 3.Morphological changes of A549 cells were observed by inverted microscope after treated with nicotine(32 μmol/L)and perforin/granzyme B alone or combination(nicotine 32 μmol/L+perforin/granzyme B)for 6 h.圖3 各組A549細胞培養6 h的細胞形態變化

4 尼古丁抑制perforin/granzyme B誘導的細胞凋亡的機制

實驗分為正常組、尼古丁32 μmol/L組，perforin/granzyme B組和聯合組(尼古丁32 μmol/L+perforin/granzyme B)共4組。尼古丁作用A549細胞6 h，收集細胞后，抽提RNA，圖4A顯示，RNA提取很好，28 S、18 S、5 S均清晰可見，未見降解片段。采用一步法擴增凋亡抑制蛋白XIAP和survivin cDNA，尼古丁32 μmol/L組的表達分別為0.736±0.029和0.569±0.047，與正常對照組比較，無顯著差異(P＞0.05);而聯合組表達遠遠高于正常組(P＜0.01)，分別為0.973±0.010和1.246±0.086。Perforin/granzyme B組的表達量最少，分別為0.432±0.070和0.452 ±0.067，見圖4B、C。

Figure 4.The mRNA expression of XIAP and survivin in A549 cells treated with nicotine(32 μmol/L)and perforin/granzyme B alone or combination for 6 h.A:total RNA evaluated by electrophoresis;B:RT－PCR analysis showing XIAP(X)，survivin(S)and β－actin(β)mRNA expression;C:The bar chart showed relative XIAP and survivin mRNA expression levels..n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs combination.圖4 各組A549細胞培養6 h XIAP和survivin mRNA的表達

討 論

在Fas/FasL發現以前，一般認為細胞毒性T細胞(CTL)的殺傷作用是通過穿孔素和顆粒酶實現的，穿孔素在Ca2+存在的條件下可以插入靶細胞膜，并多聚化形成管狀結構，破壞靶細胞膜的結構。而顆粒酶是一類絲氨酸酯酶，進入胞漿后可以直接活化胞漿中的蛋白酶，使細胞發生凋亡。細胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性細胞死亡(programmed cell death)，是多細胞有機體為調控機體發育，維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡過程。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族是繼Bcl－2家族發現的第2個在凋亡過程中主要起抗凋亡作用的家族，與Bcl－2家族不同的是IAPs家族成員均具有抗凋亡作用。近年研究發現，細胞凋亡受抑與增殖失控和分化障礙一樣在腫瘤發生與發展中起重要作用，凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的抗凋亡作用尤其受到重視。

顆粒酶B是顆粒酶家族中最有效的致凋亡成員［14］，盡管顆粒酶B也能自主進入靶細胞，不需要穿孔素的輔助，但穿孔素對凋亡過程的起始和顆粒酶進入核內有關鍵作用，因為純化的顆粒酶單獨存在不能引起靶細胞凋亡，必須兩者同時存在時，才可明顯導致靶細胞凋亡。因此，許多研究證明穿孔素和顆粒酶可作為活化細胞殺傷效應的特異性分子，是活化細胞功能診斷的可靠指標。

本文結果顯示perforin單獨作用A549細胞時，PI能進入細胞核染色，而Annexin V卻未染色，可見perforin只具有細胞打孔功能，不能引發細胞凋亡。而當加入granzyme B時，6 h孵育后即可見凋亡率達到90%以上，結果與Shi等［15］的研究具有相似性。尼古丁作用A549細胞時細胞生長受到抑制卻未引發凋亡現象，而 PCR實驗結果也顯示尼古丁32 μmol/L組的凋亡抑制蛋白表達量與正常對照組比較無顯著差異，可見這二者具有一致性。其中尼古丁高濃度組出現胞質空泡，可能由線粒體或溶酶體腫脹導致［16］。

RT－PCR結果發現聯合組作用細胞6、12 h時凋亡抑制蛋白的mRNA表達量遠遠高于其它組，分別為0.973±0.010和1.246±0.086，可能是由于XIAP及survivin的過量表達，導致細胞在聯合作用時perforin/granzyme B產生的凋亡作用不能發揮，于是未見明顯凋亡現象產生。Perforin/granzyme B組的表達量最少，因此，凋亡抑制蛋白的減少，導致凋亡發生，這與我們前面perforin聯合granzyme B時凋亡率很高的檢測結果具有一致性。

由上可知，尼古丁可以抑制perforin/granzyme B誘導的A549肺癌細胞凋亡，與尼古丁上調凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的表達有關。因此，進入到這些腫瘤細胞內的免疫毒性分子穿孔素未能啟動細胞凋亡系統和/或是已經啟動但因受到某種物質的阻斷而終止了細胞的凋亡程序，結果未能殺死腫瘤細胞。

本研究對于闡明肺癌進展過程中出現阻礙凋亡的分子作用、探討肺癌發生和發展過程中逃避機體免疫系統監視的機制均具有重要意義，可能為預防和治療肺癌提供理論基礎。

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