吲哚美辛通過Akt/GSK3β/NAG－1信號通路誘導胃癌細胞的凋亡*

龐瑞萍， 胡品津， 曾志榮， 陳 為

(中山大學1中山醫學院生理教研室，2第一附屬醫院消化內科，廣東 廣州 510080)

流行病學研究表明長期使用非甾體類消炎藥(non －steroidal anti－ inflammatory drugs，NSAIDs)可預防結腸癌、食管癌、胃癌等腫瘤的發生［1，2］。許多臨床前實驗也證實此觀點［3，4］。盡管目前NSAIDs在消化道腫瘤防治中的作用已被廣泛認可，但其作用機制尚未完全闡明。傳統觀點認為NSAIDs是通過抑制環氧合酶(cyclooxygenase，COX)而發揮抑制腫瘤的作用，但越來越多的研究表明非COX依賴途徑在其中也發揮了很重要的作用［5］。現已證實，除COX外，還有10多個靶點可介導NSAIDs的作用［6］，如核因子 κB(nuclear factor κB，NF － κB)、3 － 磷酸肌醇依賴性激酶1(3－phosphoinositide－dependent kinase 1，PDK1)/Akt、過氧化物酶體增殖子活化受體(peroxisome proliferator － activated receptor，PPAR)、NSAID活化基因(non－steroidal anti－inflammatory drug－activated gene，NAG－1)等。其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/Akt(phosphatidylinositol 3－kinase/protein kinase B/Akt，PI3K/PKB/Akt)通路既可調節細胞增殖和存活，又可以調節糖原合成，而這些都是腫瘤預防和治療的重要靶點［7，8］。我們前期的研究發現COX抑制劑可抑制胃癌細胞的增殖，誘導胃癌細胞凋亡［9］;在體實驗表明COX抑制劑可明顯抑制大鼠胃腺癌的發生［10］。進一步研究我們發現，COX抑制劑的上述作用與COX－2的表達并無明顯關系［9，11］。本研究從細胞學角度觀察吲哚美辛對胃癌細胞株生長的作用，并在此基礎上探討了吲哚美辛的作用與Akt/GSK3β/NAG－1信號通路的關系。

材料和方法

1 材料和方法

1.1 細胞培養 胃癌細胞株MGC－803由中科院上海細胞所贈送。細胞用含10%新生小牛血清(Hyclone)的DMEM培養基(Gibco)于37℃、5%CO2的培養箱內培養。以0.125%胰蛋白酶+0.020%EDTA(Sigma)消化傳代。

1.2 蛋白表達的檢測 蛋白表達測定按我們已報道的方法進行［9］。即細胞經各種處理后，用冰浴的PBS洗滌2遍，隨后加入裂解緩沖液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris － HCl，1 g/L SDS，0.2 g/L NaN3，5 mg/L aprotinin，1.0 mmol/L PMSF，1.0 g/L NP40，5.0 g/L 脫氧膽酸鈉，pH 8.0)，混勻后冰浴30 min，刮取細胞。樣品經4℃、12000×g離心5 min后，取上清即蛋白提取液。蛋白定量后分別通過SDS－PAGE電泳分離蛋白和電轉使蛋白轉移至PVDF膜。用PBST洗脫PVDF膜5 min后，室溫下封閉1 h。加入不同稀釋的Ⅰ抗，室溫溫育2 h或4℃過夜。經PBST洗3次后加入相對應的Ⅱ抗，室溫孵育2 h。PBST洗脫后經曝光、顯影和定影，吸光度值(absorbance，A)通過凝膠成像系統及相應軟件分析。

1.3 MTT法測定吲哚美辛對胃癌細胞活力的影響按我們已報道的方法進行［9］。將細胞(105cells/well)接種于96孔板，24 h后，依不同處理因素處理相應時間后，加入5 g/L MTT(四甲基偶氮唑鹽，上海生物工程公司)10 μL/well，培養箱內繼續孵育，4 h后吸去培養基，加入 DMSO(Sigma)100 μL/well，置酶標儀上(測定波長570 nm)測定A值。細胞活力(%)=(處理組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%。

1.4 吲哚美辛誘導胃癌細胞凋亡的檢測 細胞凋亡檢測按我們已報道的方法進行［9］。①Hoechst 33258核染色法 細胞經處理后，用多聚甲醛液(40 g/L，Sigma)固定10 min，蒸餾水洗滌后加入5 mg/L Hoechst33258(Promega)，10 min后蒸餾水洗細胞2次，自然干燥后，細胞置于熒光顯微鏡下(340 nm激發光)觀察并拍照。②流式細胞儀檢測 細胞(1×109/L)用PBS洗2次，以70%乙醇(4℃)固定過夜。離心棄乙醇，細胞重懸于含有50 mg/L碘化丙啶和50 mg/L RNase A的染色液中避光染色30 min。以流式細胞儀測定，每樣品計數12000個細胞，記錄熒光強度值并以相應軟件處理結果，計算凋亡率。

2 統計學處理

結 果

1 吲哚美辛對胃癌細胞株MGC－803活力的影響

MTT檢測結果顯示100－600 μmol/L吲哚美辛處理MGC－803細胞12、24和48 h后，細胞的活力隨劑量增加和時間延長而降低，見圖1。

Figure 1.Effects of indomethacin on viability of MGC－803 cells.MGC －803 cells were treated with indomethacin(100 －600 μmol/L)or DMSO vehicle(0.1%)for 12，24 and 48 h.The cell viability showed a concentration－and time－dependent reduction..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DMSO.圖1 吲哚美辛對MGC－803細胞活力的影響

2 吲哚美辛誘導MGC－803細胞的凋亡

Hoechst 33258核染色法結果表明，未加吲哚美辛的MGC－803細胞，胞核較大，淺染，呈彌散均勻熒光;500 μmol/L吲哚美辛處理12 h后胞核形態變得不規則，呈條紋狀或裂隙狀，并見部分細胞的染色質濃縮;處理24 h后染色質進一步凝集;處理48 h后，可見染色質裂解呈塊狀，見圖2。

流式細胞術檢測發現500 μmol/L吲哚美辛處理后各組均出現明顯的凋亡峰。對照組細胞凋亡百分率為(3.9±1.6)%，吲哚美辛處理12、24和48 h組細胞凋亡率分別為(19.6±3.5)%、(38.8±6.1)%和(56.6±9.7)%，P ＜0.01，見圖3。

Figure 2.Morphological changes of MGC －803 cells induced by indomethacin(×400).After treated with 500 μmol/L indomethacin for 12，24 and 48 h，apoptotic bodies could be observed under fluorescent microscope.圖2 吲哚美辛作用后MGC－803細胞形態學的變化

Figure 3.MGC －803 cell apoptosis after treatment with indomethacin(500 μmol/L)for 12，24 and 48 h analyzed by flow cytometry.圖3 流式細胞術檢測吲哚美辛處理后MGC－803細胞的凋亡率

3 吲哚美辛誘導caspase－3的活化

500 μmol/L吲哚美辛處理細胞12、24和48 h后，caspase－3酶原被激活，蛋白免疫印跡顯示17 kD的活化caspase－3片段，其作用存在時間依賴性，見圖4A。廣譜caspase抑制劑zVAD－fmk 100 μmol/L可明顯抑制吲哚美辛引起的caspase－3酶原的活化，見圖4B。而且zVAD－fmk 100 μmol/L預處理后可顯著降低吲哚美辛誘導的細胞凋亡作用，見圖4C。這提示吲哚美辛主要通過caspase通路誘導胃癌細胞的凋亡。

Figure 4.Effects of z－VAD－fmk on indomethacin－induced apoptosis.MGC －803 cells were treated with 500 μmol/L indomethacin for 6，12 and 24 h(A)or 24 h in the presence or absence of 100 μmol/L z－VAD－fmk(z－VAD －fmk was added to the cells 2 h prior to indomethacin treatment;DMSO vehicle concentration:0.1%)(B).Proteins were extracted and used for the detection of caspase－3 cleavage by Western blotting.C:indomethacin－induced reduction of cell viability was partially prevented by pretreatment with z－VAD－fmk.Indo:indomethacin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs indomethacin group.圖4 廣譜caspase抑制劑z－VAD－fmk對吲哚美辛誘導MGC－803細胞凋亡的作用

4 吲哚美辛對Akt和GSK3β磷酸化的影響

吲哚美辛(500 μmol/L)作用于MGC－803細胞后，總Akt蛋白表達無明顯變化，而Ser473位點磷酸化Akt的表達水平明顯降低，見圖5A、C。

吲哚美辛作用后，細胞總GSK3β的表達無顯著變化，而GSK3β Ser9磷酸化水平降低，見圖5B、D。

Figure 5.Effects of indomethacin on the phosphorylation of Akt and GSK3β in MGC －803 cells.Indomethacin(500 μmol/L)treatment inhibited the phosphorylation of Akt(Ser473)(A，C)and GSK3β (Ser9)(B，D)in MGC －803 cells，but did not change the total Akt and GSK3β.Indo:indomethacin..n=4.＊＊P＜0.01 vs corresponding control.圖5 吲哚美辛對MGC－803細胞Akt和GSK3β磷酸化的影響

5 吲哚美辛通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路誘導NAG－1的表達

吲哚美辛可以增加NAG－1的表達，而單獨應用PI3K抑制劑 LY294002(20 μmol/L)和 Akt抑制劑1L－6－hydroxymethyl－chiro－inositol 2(R)－2－O －octadecylcarbonate(10 μmol/L)處理后，也可增加NAG－1蛋白表達。預先加入 GSK3β抑制劑SB216763(10 μmol/L)孵育1 h可完全取消PI3K抑制劑和Akt抑制劑誘導NAG－1表達的作用，見圖6A、C。PI3K 抑制劑 LY294002(20 μmol/L)和 Akt抑制劑(10 μmol/L)預孵育 1 h 后再加入500 μmol/L吲哚美辛，NAG－1的表達水平與單用吲哚美辛相比無顯著差異。而預先加入 GSK3β抑制劑SB216763(10 μmol/L)孵育1 h，則完全取消吲哚美辛誘導NAG－1表達的作用，見圖6B、D。

6 GSK3β抑制劑對吲哚美辛誘導胃癌細胞凋亡的影響

預先加入SB216763(10 μmol/L)孵育1 h可顯著抑制吲哚美辛誘導細胞凋亡的作用，見圖7。

Figure 6.Effects of PI3K，Akt and GSK3β inhibitors on NAG －1 expression induced by indomethacin in MGC －803 cells.MGC －803 cells were treated with 20 μmol/L LY294002，a specific PI3K inhibitor，or 10 μmol/L 1L －6 － hydroxymethyl－ chiro － inositol 2(R)－2－O －octadecylcarbonate，a selective Akt inhibitor，or pre－addition of 10 μmol/L SB216763，a selective GSK3β inhibitor for 12 h in the presence(B，D)or absence(A，C)of 500 μmol/L indomethacin.The cell lysates were harvested for Western blotting analysis using anti－NAG－1 antibody..n=5.＊＊P＜0.01 vs control.圖6 PI3K、Akt和GSK3β抑制劑對吲哚美辛誘導MGC－803細胞NAG－1表達的影響

Figure 7.GSK3β inhibitor blocks the indomethacin－induced inhibition of cells growth.Indomethacin－induced reduction of cell viability was prevented by pretreatment with 10 μmol/L SB216763(SB216763 was added to the cells 1 h prior to indomethacin treatment;DMSO vehicle concentration:0.1%).Indo:indomethacin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs indomethacin group.圖7 GSK3β抑制劑可阻斷吲哚美辛誘導的細胞凋亡作用

討 論

Akt(PKB)是細胞存活和凋亡的重要調節因子，Akt的磷酸化可保護多種類型細胞的凋亡。越來越多的證據顯示Akt可通過促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡參與腫瘤的發生和發展［12］。在肺癌和肝癌細胞，研究表明Akt的磷酸化參與了COX－2介導的促細胞存活過程［12，13］。Akt的磷酸化位點包括催化結構域的Thr308位點和調節結構域的Ser473位點。Thr308位點的磷酸化只能部分激活Akt，只有2個位點的磷酸化才能使Akt充分活化。已有研究表明，NSAIDs誘導前列腺癌、肝細胞肝癌等的凋亡作用與抑制Akt Thr308和Ser473位點的磷酸化水平相關［14，15］。在人結腸癌細胞株 HT －29 細胞，celecoxib誘導細胞凋亡作用同時Akt和GSK3β磷酸化水平均被明顯抑制［16］。活化后的Akt主要通過對含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發揮作用。GSK3β是Akt的重要底物之一，它作為細胞凋亡的上游調節因子，參與調控多種細胞的凋亡過程［17］。在基礎狀態下，GSK3β即有較高的活性。Akt通過磷酸化GSK3β的Ser9而抑制其活性。最近有報道認為celecoxib可通過抑制PI3K/Akt/GSK3β通路誘導結腸癌細胞的凋亡［18］。本實驗中，我們在MGC－803細胞檢測到基礎狀態Akt Ser473位點和GSK3β Ser9位點的磷酸化，吲哚美辛可明顯抑制 Akt Ser473和GSK3β Ser9的磷酸化水平，而對總的 Akt和總GSK3β表達水平無影響。進一步研究發現，GSK3β選擇性抑制劑 SB216763可幾乎完全逆轉吲哚美辛誘導MGC－803細胞凋亡的作用。這些結果說明吲哚美辛是通過Akt/GSK3β信號通路誘導MGC－803細胞凋亡。但GSK3β的信號下游底物尚未明了。

NAG－1又稱為巨噬細胞抑制因子1(macrophage inhibitory factor 1，MIF－1)、生長分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF－15)等，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF－β)超家族成員。已有的研究表明，NAG－1過表達可抑制乳腺癌細胞、上皮腫瘤細胞和前列腺癌細胞的增殖［18，19］，而且 NAG －1 過表達的人結腸癌和膠質瘤細胞種植于裸鼠后，其成瘤能力明顯降低［20，21］。進一步研究顯示，NAG－1過表達可引起前列腺癌細胞產生 caspase依賴性的凋亡［22］。這些結果提示NAG－1與腫瘤的發生密切相關。但NAG－1的調控機制尚未完全清楚。已知NSAIDs可誘導NAG－1蛋白表達的上調。已有研究認為NSAIDs主要是通過早期生長反應基因－1(early growth response gene－1，EGR －1)上調 NAG －1的表達［23］。最近有研究提示 NAG －1的表達受 PI3K/Akt/GSK3β［24］信號通路調控。我們的實驗發現，在MGC－803細胞，吲哚美辛可誘導NAG－1的表達上調。單用PI3K抑制劑和Akt抑制劑亦可明顯上調NAG－1的表達，預先加入GSK3β抑制劑則完全取消PI3K抑制劑和Akt抑制劑對 NAG－1的作用，提示 PI3K/Akt/GSK3β信號通路參與調控MGC－803細胞NAG－1的表達。我們的結果與結腸癌細胞上的研究結果相一致［23］。如預先加入GSK3β抑制劑則可取消吲哚美辛上調NAG－1表達的作用，而在PI3K抑制劑和Akt抑制劑作用的基礎上，吲哚美辛對NAG－1表達的上調作用與單用吲哚美辛相比并無差異。提示在胃癌細胞株MGC－803細胞，吲哚美辛主要是通過Akt/GSK3β信號通路上調NAG－1的表達。

綜上所述，我們的結果表明，在胃癌細胞株MGC－803細胞，非選擇性COX抑制劑吲哚美辛主要是通過Akt/GSK3β信號通路上調NAG－1的表達，進而誘導細胞的凋亡。

［1］Kelloff GJ，Boone CW，Crowell JA，et al.Chemopreventive drug development:perspectives and progress［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1994，3(1):85 －98.

［2］Rothwell PM，Fowkes FG，Belch JF，et al.Effect of daily aspirin on long－term risk of death due to cancer:analysis of individual patient data from randomised trials［J］.Lancet，2011，377(9759):31 －41.

［3］Dubois RN，Abramson SB，Crofford L，et al.Cyclooxygenase in biology and disease［J］.FASEB J，1998，12(12):1063－1073.

［4］D＇Arca D，LeNoir J，Wildemore B，et al.Prevention of urinary bladder cancer in the FHIT knock－out mouse with Rofecoxib，a Cox － 2 inhibitor［J］.Urol Oncol，2010，28(2):189－194.

［5］Tegeder I，Pfeilschifter J，Geisslinger G.Cyclooxygenase－ independent actions of cyclooxygenase inhibitors［J］.FASEB J，2001，15(12):2057 －2072.

［6］Soh JW，Weinstein IB.Role of COX －independent targets of NSAIDs and related compounds in cancer prevention and treatment［J］.Prog Exp Tumor Res，2003，37:261 － 285.

［7］Carracedo A，Pandolfi PP.The PTEN－PI3K pathway:of feedbacks and cross － talks［J］.Oncogene，2008，27(41):5527－5541.

［8］LoPiccolo J，Blumenthal GM，Bernstein WB，et al.Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway:effective combinations and clinical considerations［J］.Drug Resist Updat，2008，11(1 －2):32 －50.

［9］龐瑞萍，胡品津，曾志榮，等.塞來昔布誘導不表達環氧合酶－2的胃癌細胞凋亡研究［J］.中國病理生理雜志，2006，22(5):842 －845.

［10］Hu PJ，Yu J，Zeng ZR，et al.Chemoprevention of gastric cancer by celecoxib in rats［J］.Gut，2004，53(2):195－200.

［11］Yu J，Tang BD，Leung WK，et al.Different cell kinetic changes in rat stomach cancer after treatment with celecoxib or indomethacin:implications on chemoprevention［J］.World J Gastroenterol，2005，11(1):41 － 45.

［12］Sánchez－ Alcázar JA，Bradbury DA，Pang L，et al.Cyclooxygenase(COX)inhibitors induce apoptosis in nonsmall cell lung cancer through cyclooxygenase independent pathways［J］.Lung Cancer，2003，40(1):33 － 44.

［13］Vivanco I，Sawyers CL.The phosphatidylinositol 3－kinase － AKT pathway in human cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(7):489 －501.

［14］Kulp SK，Yang YT，Hung CC，et al.3－Phosphoinositide－dependent protein kinase－1/Akt signaling represents a major cyclooxygenase－2－independent target for celecoxib in prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2004，64(4):1444－1451.

［15］Leng J，Han C，Demetris AJ，et al.Cyclooxygenase － 2 promotes hepatocellular carcinoma cell growth through Akt activation:evidence for Akt inhibition in celecoxib－induced apoptosis［J］.Hepatology，2003，38(3):756 －758.

［16］Arico S，Pattingre S，Bauvy C，et al.Celecoxib induces apoptosis by inhibiting 3－phosphoinositide－dependent protein kinase－1 activity in the human colon cancer HT－29 cell line［J］.J Biol Chem，2002，277(31):27613 －27621.

［17］Bijur GN，Jope RS.Proapoptotic stimuli induce nuclear accumulation of glycogen synthase kinase－3β［J］.J Biol Chem，2001，276(40):37436 －37442.

［18］Li PX，Wong J，Ayed A，et al.Placental transforming growth factor－β is a downstream mediator of the growth arrest and apoptotic response of tumor cells to DNA damage and p53 overexpression［J］.J Biol Chem，2000，275(26):20127－20135.

［19］Tan M，Wang Y，Guan K，et al.PTGF － β，a type β transforming growth factor(TGF－β)superfamily member，is a p53 target gene that inhibits tumor cell growth via TGF － β signaling pathway［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(1):109 －114.

［20］Baek SJ，Kim KS，Nixon JB，et al.Cyclooxygenase inhibitors regulate the expression of a TGF－β superfamily member that has proapoptotic and antitumorigenic activities［J］.Mol Pharmacol，2001，59(4):901 －908.

［21］Albertoni M，Shaw PH，Nozaki M，et al.Anoxia induces macrophage inhibitory cytokine－1(MIC－1)in glioblastoma cells independently of p53 and HIF －1［J］.Oncogene，2002，21(27):4212 －4219.

［22］Liu T，Bauskin AR，Zaunders J，et al.Macrophage inhibitory cytokine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2003，63(16):5034－5040.

［23］Baek SJ，Kim JS，Moore SM，et al.Cyclooxygenase inhibitors induce the expression of the tumor suppressor gene EGR－1，which results in the up－regulation of NAG－1，an antitumorigenic protein［J］.Mol Pharmacol，2005，67(2):356－364.

［24］Yamaguchi K，Lee SH，Eling TE，et al.Identification of nonsteroidal anti－inflammatory drug－activated gene(NAG－1)as a novel downstream target of phosphatidylinositol 3－kinase/AKT/GSK －3β pathway［J］.J Biol Chem，2004，279(48):49617 －49623.