可溶性TGFβRⅡ對大鼠心肌梗死后心功能的影響*

張玲玲， 劉增長， 蘇 立， 殷躍輝

(重慶醫科大學附屬第二醫院心血管內科，重慶 400010)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是危害人類健康的常見心血管疾病之一，MI后常發生心肌纖維化，引起心室重塑，使得心臟收縮和(或)舒張功能受損，并最終導致慢性心力衰竭的發生發展。心肌纖維化不僅發生在梗死區，同時也發生在非梗死區，包含成纖維細胞的增殖和細胞外基質(extracellular martrix，ECM)的沉積，與整個心室腔的擴張、變形及心功能降低密切相關。作為強有力的致纖維化因子之一，轉化生長因子β(transforming growth factor－β，TGF－β)在MI后大鼠心臟梗死區和非梗死區的表達明顯上調，在心肌纖維化過程中發揮關鍵作用［1］。lsaka等［2］研究發現，可溶性轉化生長因子βⅡ型受體(soluble transforming growth factor－β typeⅡreceptor，sTGFβRⅡ)能競爭性抑制內源性TGF－βRⅡ與TGF－β的結合或是作為負效應受體起作用，減輕實驗性腎小球腎炎ECM的聚集，改善腎小球纖維化。然而，有關sTGFβRⅡ能否逆轉心肌纖維化的研究國內外鮮有報道。因此，本研究旨在觀察重組腺病毒載體pAd－sTGFβRⅡ對TGF－β介導的心肌纖維化的調節，探討sTGFβRⅡ對大鼠MI后心功能的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠50只，體重200－250 g，由重慶醫科大學動物中心提供，動物使用許可證號為SYXK(渝)2007－0001。

1.2 主要試劑和儀器 重組腺病毒載體 pAdsTGFβ RⅡ由本課題組前期構建;Trizol試劑、逆轉錄(PrimeScriptTM)試劑盒(TaKaRa);Pfu PCR Master Mix試劑(北京天根生化科技有限公司);多聚賴氨酸溶液、兔抗鼠基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP－9)多克隆抗體、SP免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術有限公司);明膠(Sigma)。TKR－200小動物呼吸機(江西特力麻醉呼吸設備有限公司);IX－70型偏振光學顯微鏡(Olympus);752型紫外分光光度儀(上海青華科技儀器公司);Thermo Hybaid Px2型PCR儀(Eppendorf);核酸電泳裝置、Gel Doc 100型凝膠成像掃描分析儀(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 MI大鼠模型的制備、分組及處理 40只SD大鼠稱重后經3.5%水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定、備皮、消毒。用針形電極插入四肢皮下連接心電圖機，觀察記錄肢體導聯心電圖。切開氣管并插管，接上小動物呼吸機進行正壓通氣(潮氣量20 mL，機械通氣頻率80次/min，呼吸比1∶1);在胸骨左緣捫及心臟搏動處縱行切開皮膚約3 cm，逐層鈍性分離，于第3、4肋間開胸，暴露心臟，在肺動脈圓錐和左心耳之間于左心耳根部下方2 mm處進針，以6/0無損傷縫線穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針結扎左冠狀動脈前降支，肉眼觀察左心室前壁變蒼白，同時在2個及以上肢體導聯出現ST段弓背向上抬高0.2 mV以上，說明MI模型已成功建立;迅速將心臟復位，排盡氣體，逐層關胸;待大鼠清醒時，拔除氣管插管;術畢肌肉注射青霉素4×105U預防感染。術后3 d存活31只，隨機分為 MI組(生理鹽水 1 mL，n=10)、pAdsTGFβRⅡ組(pAdTrack－TO4－ sTGFβRⅡ病毒上清液，1.0×1010pfu 1 mL，n=11)、空載體組(pAdTrack，1.0 ×1010pfu 1 mL，n=10);另設假手術組(僅在左冠脈前降支相同部位穿線并不縫扎，生理鹽水1 mL，n=10)。干預方式為術后第4 d下肢肌肉注射，方法同Okada等［3］研究，之后在相同條件下喂養，觀察4周。

2.2 超聲心動圖檢測 4周后麻醉大鼠，應用GE Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(探頭頻率13 MHz，深度3.5 cm，速度200 mm/s)在獲得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后，測量心率(heart rate，HR)、左心室舒張末期直徑(left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末期直徑(left ventricular end－systolic dimension，LVESD)和射血分數(ejection fraction，EF)，取連續3個心動周期的平均值。

2.3 標本留取 超聲心動圖檢測后，大鼠稱重并處死，開胸取心臟，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干，沿房室溝剔除心房、血管組織，緊貼室間隔右下側剔除右心室游離壁，余下左心室，沿梗死區中部垂直于長軸的方向切取厚約3－5 mm的心肌組織塊放入4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，常規脫水，透明，石蠟包埋，切片備用，切片厚度約5 μm。余下部分經液氮速凍后轉－80℃冰箱保存，用于冰凍切片、RT－PCR和明膠酶譜法檢測。所有標本制作條件完全相同以避免人工誤差。

2.4 冰凍切片檢測sTGFβRⅡ基因的表達 取液氮凍存的心肌組織做冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞的數量和密度，檢測sTGFβRⅡ基因在心肌組織中的表達情況。

2.5 天狼星紅－飽和苦味酸染色觀察心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達 石蠟切片常規脫蠟入水，雙蒸水洗;切片入Harris蘇木素染液5 min;自來水洗10 min;鹽酸乙醇分色10s，水洗;入天狼星紅－飽和苦味酸染液30 min;自來水速洗，蒸餾水洗，濾紙吸干;無水乙醇分化與脫水;二甲苯透明;適量中性樹膠封片。偏振光學顯微鏡下觀察心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的染色情況。

2.6 RT－PCR法檢測左心室非梗死區 MMP－9 mRNA的表達 (1)RNA提取:按照Trizol試劑說明書提取總RNA，并溶于20 μL DEPC處理水中。(2)RNA純度及濃度測定:用1 mL蒸餾水將紫外分光光度計校正調零。將1 μL RNA樣品與1 mL蒸餾水混勻，轉入石英杯中，分別讀取A260和A280值，計算RNA樣品中的A260/A280，以該比值≥2.0為純度合格，其樣品進入后續實驗;按下列公式計算RNA樣品濃度:RNA樣品濃度(g/L)=A260值×40×稀釋倍數×10－3，用無RNA酶純水將RNA樣品濃度調至1 g/L。(3)RT反應:應用TaKaRa逆轉錄試劑盒按照說明書進行 cDNA第 1鏈合成。(4)PCR反應:根據PubMed上GenBank提供的基因序列，以β－actin基因為內參照，擴增MMP－9基因(NM 031055.1)的引物序列，上游引物 5＇－CCCTGCGTATTTCCATTCATC －3＇，下游引物 5＇－ GGCTTGGGTCAGGTTTAGAG－3＇，PCR產物的大小為500 bp;擴增β－actin(NM 031144.2)的引物序列，上游引物5＇－CACCCGCGAGTACAACCTTC －3＇，下游引物 5＇－ CCCATACCCACCATCACACC－3＇，PCR 產物的大小為 250 bp。上述引物由上海生物工程有限公司合成。PCR條件為:94℃預變性3 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃45 s，共35個循環;再72℃ 5 min。(5)PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像掃描分析儀攝像，結果用Quantity One 4.6.2軟件分析后計算MMP－9與β－actin吸光度比值代表其相對表達量。

2.7 免疫組織化學方法檢測心肌MMP－9蛋白的表達 采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)法進行免疫組化檢測。石蠟切片常規脫蠟水化，微波加熱修復抗原20 min，冷卻至室溫;3%H2O2去離子水室溫孵育30 min滅活內源性過氧化物酶，PBS洗滌5 min×3次;每張切片滴加50 μL正常山羊血清封閉液，室溫孵育30 min，甩去余液;每張切片滴加50 μL PBS緩沖液稀釋的的兔抗鼠MMP－9多克隆Ⅰ抗(1∶50);4℃冰箱過液，37℃復溫45 min，PBS洗滌5 min×3次;滴加生物變化Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次;滴加鏈霉素抗生物素－過氧化物酶溶液，37℃ 孵育20 min;DAB顯色;蘇木精輕度復染;分色、脫水、透明和封片。同時用PBS代替MMP－9Ⅰ抗作陰性對照。免疫組化染色結果用Image－Pro Plus 4.5圖像分析軟件測量蛋白表達的累積吸光度值(integrated absorbance，IA)和平均吸光度值，其值越大分別代表蛋白表達量越多、強度越高。

2.8 明膠酶譜法檢測心肌MMP－9的活性 取液氮凍存的心肌組織0.3 g加入1 mL蛋白提取液勻漿，12000 r/min、4℃離心20 min，取上清分裝，用Bradford法蛋白定量;與上樣緩沖液以1∶2混合后上樣于含1%明膠的8%SDS－聚丙烯酰胺凝膠，加marker后電泳(60 V，30 min;100 V 120 min);電泳結束后將凝膠置于2.5%Triton X－100溶液中室溫搖洗2次，每次30 min;然后以漂洗液(50 mmol/L Tris－HCl，5 mmol/L CaCl2，pH 7.6)漂洗2 次，每次20 min，再置于新鮮孵育液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 7.5， 10 mmol/L CaCl2， 150 mmol/L NaCl，0.02%NaN3)中37℃孵育24 h;棄去孵育緩沖液，加入0.25%考馬斯亮藍染液染色3 h，用脫色液脫色至背景清晰為止;用Gel Doc 100型凝膠成像掃描分析儀在灰階模式下掃描，結果用Quantity One 4.6.2軟件分析以條帶的吸光度值相對定量心肌MMP－9的活性。

3 統計學處理

結 果

1 各組大鼠心臟超聲心動圖檢測結果

MI后4周，與假手術組比較，MI組、空載體組HR、LVEDD和 LVESD均明顯升高(P＜0.01)，EF值明顯降低(P＜0.01);pAd－sTGFβRⅡ組僅LVEDD升高(P ＜0.05)，HR、LVESD、EF值無顯著差異。與MI組比較，pAd－sTGFβRⅡ組HR、LVEDD和LVESD均明顯減小(P＜0.01)，EF值明顯增高(P＜0.01);空載體組各項指標與MI組比較無顯著差異，見表1。

表1 MI后4周各組大鼠超聲心動圖各項指標的檢測結果Table 1.The evaluation of HR，LVEDD，LVESD and EF of the rats in various groups by echocardiograms(.n=10)

表1 MI后4周各組大鼠超聲心動圖各項指標的檢測結果Table 1.The evaluation of HR，LVEDD，LVESD and EF of the rats in various groups by echocardiograms(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.

Group HR(min－1) LVEDD(mm) LVESD(mm) EF(%)Sham 458.00 ±4.06 4.80 ±0.41 2.89 ±0.31 68.08 ±2.89 MI 473.00 ±10.36＊＊ 7.10 ±0.31＊＊ 4.86 ±0.43＊＊ 37.27 ±3.62＊＊pAd － sTGFβRⅡ 460.77 ±5.76## 5.25 ±0.33*## 3.21 ±0.34## 57.38 ±4.13##Vector 469.58 ±7.12＊＊ 7.01 ±0.35＊＊ 4.98 ±0.27＊＊ 35.54 ±3.52＊＊

2 冰凍切片檢測sTGFβRⅡ基因的表達結果

重組腺病毒載體pAd－sTGFβRⅡ含有綠色熒光蛋白基因，假手術組大鼠心肌組織中無綠色熒光蛋白，pAd－sTGFβRⅡ組可見大量的綠色熒光蛋白表達，表明sTGFβRⅡ基因在心肌組織中得到高效表達，見圖1。

3 天狼星紅－飽和苦味酸染色結果

偏振光學顯微鏡下觀察:Ⅰ型膠原纖維呈紅色或黃色，排列緊密，具強雙折光性;Ⅲ型膠原纖維呈綠色，細纖維，弱雙折光性。與假手術組比較，MI組和空載體組左心室非梗死區Ⅰ型和Ⅲ型膠原均顯著增加，其中以Ⅰ型膠原增加更為顯著，提示MI晚期膠原網絡重塑以Ⅰ型膠原增生為主。MI組與空載體組之間無明顯差異。與MI組比較，pAd－sTGFβRⅡ組非梗死區Ⅰ型和Ⅲ型膠原均明顯減少，但與假手術組相比其表達仍稍有增加，見圖2。

Figure 1.Expression of sTGFβRⅡ gene in myocardial tissues of rats in sham group(A)and pAd－sTGFβRⅡ group(B)(frozen section，×400).圖1 心肌組織sTGFβRⅡ基因的表達結果

Figure 2.Content and distribution of collagen typeⅠ andⅢ in the left ventricular non－infarcted zone of rats in sham group(A)，MI group(B)，pAd－sTGFβRⅡ group(C)and vector group(D)(picrosirius red staining，×400).圖2 各組大鼠左心室非梗死區Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達

4 MMP－9 mRNA表達的瓊脂糖凝膠電泳分析

MI后4周，MMP－9 mRNA相對表達量在假手術組、MI組、pAd－sTGFβRⅡ組和空載體組分別為0.392±0.008、0.526 ±0.021、0.436±0.012 和0.499±0.017。與假手術組比較，其余3組左心室非梗死區MMP－9 mRNA的表達量明顯增加(均P＜0.01);與 MI組比較，pAd－sTGFβRⅡ組 MMP－9 mRNA的表達量明顯減少(P＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Expression of MMP－9 mRNA in the left ventricular non－infarcted zone of rats in various groups.A:agarose gel electrophoresis.Lane 1:sham group;Lane 2:MI group;Lane 3:pAd －sTGFβRⅡ group;Lane 4:vector group.B:the relative expression normalized with β－actin..n=10.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖3 MI 4周后各組大鼠左心室非梗死區MMP－9 mRNA表達量

Figure 4.Expression of MMP－9 protein in myocardial tissues of rats in sham group(A)，MI group(B)，pAd－sTGFβRⅡ group(C)and vector group(D)(immunohistochemical staining，×400).圖4 各組大鼠心肌組織MMP－9蛋白表達情況

5 MMP－9蛋白免疫組化染色結果

圖4顯示，MMP－9陽性染色定位于心肌細胞漿和成纖維細胞漿，呈棕黃色。與假手術組比較，MI組、pAd－sTGFβRⅡ組和空載體組左心室非梗死區MMP－9蛋白表達量增加(均 P＜0.01);與MI組比較，pAd－sTGFβRⅡ組 MMP－9蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01)，空載體組無明顯差異，見圖4、表2。

表2 MI 4周后各組大鼠心肌組織MMP－9蛋白表達量的比較Table 2.MMP－9 protein content in myocardial tissues of rats in various groups(.n=10)

表2 MI 4周后各組大鼠心肌組織MMP－9蛋白表達量的比較Table 2.MMP－9 protein content in myocardial tissues of rats in various groups(.n=10)

IA:integrated absorbance.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.

Group IA AverageA Sham 61538.6 ±3269.5 0.0076 ±0.0003 MI 332829.2 ±16883.7＊＊ 0.0462 ±0.0023＊＊pAd － sTGFβRⅡ 172623.1 ±15087.4＊＊## 0.0222 ±0.0021＊＊##Vector 312730.3 ±16338.3＊＊ 0.0445 ±0.0025＊＊

Figure 5.The activity of MMP －9 in myocardial tissues of rats in various groups.A:gelatin zymography to detect MMP －9 activity.Lane 1:sham group;Lane 2:MI group;Lane 3:pAd－sTGFβRⅡ group;Lane 4:vector group.B:the protein activity was quantified..n=5.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖5 MI 4周后各組大鼠心肌組織MMP－9的活性

6 心肌MMP－9活性測定結果

圖5顯示，84 kD處有1條酶條帶，為MMP－9的活性形式。MMP－9蛋白表達活性在假手術組、MI組、pAd－sTGFβRⅡ組和空載體組分別為0.35±0.03、1.78±0.08、1.32±0.11和1.83±0.07。與假手術組比較，其余3組左心室心肌MMP－9的活性顯著升高(均 P＜0.01);與 MI組比較，pAdsTGFβRⅡ組MMP－9的活性顯著降低(P＜0.01)。

討 論

心肌纖維化被公認為是MI后心力衰竭發生發展的重要環節。如何減緩或逆轉MI后心肌纖維化成為近年來臨床和基礎研究的熱點。近年來研究發現，TGF－β可刺激成纖維細胞增殖，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化及ECM大量合成，促進心肌纖維化的發生和發展［4，5］。因此，抑制 TGF－ β 介導的生物學效應有可能成為未來預防MI后心力衰竭發生的有效策略。本研究采用攜帶sTGFβRⅡ基因的重組腺病毒載體pAd－sTGFβRⅡ轉染MI大鼠，使其在心肌組織中得到高效表達，與內源性TGFβRⅡ競爭性結合TGF－β，由于不包含胞內激酶區而不能磷酸化，TGF－β信號下傳受到抑制，心肌纖維化減輕，心功能得到改善，與Lian等［8］的研究結果相似。

MI后心肌間質膠原重塑是指膠原的形態、結構、生化(包括膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比例、特性、構型、排列等)發生異常改變。有研究發現MI后心肌間質Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成顯著增加及Ⅰ/Ⅲ型膠原比例失調，使得心肌僵硬度增加、心臟順應性降低及心室腔擴大，最終導致心臟舒縮功能不全［9］。本研究觀察了MI 4周的大鼠左心室非梗死區膠原重塑方面的改變，發現MI組與空載體組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量和Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較假手術組均明顯增加，表明MI后心肌成纖維細胞合成和分泌膠原蛋白增加，膠原類型比例改變及心肌膠原網絡重塑以Ⅰ型膠原增生為主;而pAd－sTGFβRⅡ組低于MI組，表明抑制TGF－β信號能減少左心室非梗死區Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，同時還能改善膠原類型比例，逆轉膠原重塑，與Ellmers等［10］研究結果一致。另外，本研究發現MI組與空載體組HR、LVEDD和LVESD較假手術組均明顯升高，EF值顯著降低，提示MI后心功能明顯下降可能與膠原沉積尤其是Ⅰ型膠原增加顯著使心室壁順應性下降有關;而pAd－sTGFβRⅡ組上述改變明顯減輕，表明sTGFβRⅡ干預使MI后左心室功能得到改善。

基質金屬蛋白酶是降解ECM的最主要酶系，其表達量和活性升高將使膠原蛋白纖維化反應性增加，相反MMP的表達量和活性降低將改善心肌纖維化［11］。MMP－9可降解明膠和正常的膠原蛋白，使心肌間質被缺乏連接結構的纖維化間質所取代，導致心室擴大，心功能降低。亦有研究發現MMP－9基因缺陷小鼠MI后LVEDD和LVESD均比野生型小鼠顯著減小，膠原沉積亦減少，左心室擴張得到改善，且心臟破裂的發生率明顯降低，足見MMP－9在MI后基質代謝和心肌纖維化中的作用［12］。本研究發現MI后左心室非梗死區MMP－9 mRNA、蛋白表達水平及其活性均明顯增高，但pAd－sTGFβRⅡ組較MI組、空載體組明顯降低，并同時伴隨Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的減少和膠原類型的改善，表明sTGFβRⅡ抑制TGF－β介導的MMP－9表達可能是改善MI后心肌間質膠原重塑并最終減輕心肌纖維化的機制之一。由于調控MMP－9活性和表達的因素有很多，我們仍需更多的研究去探討MMP－9是否可作為MI后心肌纖維化的治療靶標。

總之，本研究表明sTGFβRⅡ干預能夠改善MI后左心室功能，其作用機制可能與其下調MMP－9的表達、改善心肌間質膠原重塑、減輕心肌纖維化有關。

［1］Liu Y，Liao Y，Cheng X，et al.TGF－β1of cardiac tissue and ventricular remodeling in rats with acute myocardial infarction［J］.Chin J Pathophysiol(中國病理生理雜志)，2005，21(12):2305－2309.

［2］Isaka Y，Akagi Y，Ando Y，et al.Gene therapy by transforming growth factor－β receptor－IgG Fc chimera suppressed extracellular matrix accumulation in experimental glomerulonephritis［J］.Kidney Int，1999，55(2):465－475.

［3］Okada H，Takemura G，Kosai K，et al.Postinfarction gene therapy against transforming growth factor－β signal modulates infarct tissue dynamics and attenuates left ventricular remodeling and heart failure ［J］.Circulation，2005，111(19):2430－2437.

［4］郭張強，廖玉華，李 彬，等.大鼠急性心肌梗死后心室重塑中細胞因子與膠原的變化［J］.中國病理生理雜志，2006，22(12):2322－2327.

［5］Dobaczewski M，Bujak M，Li N，et al.Smad3 signaling critically regulates fibroblast phenotype and function in healing myocardial infarction［J］.Circ Res，2010，107(3):418－428.

［6］Lian R，Chen Y，Xu Z，et al.Soluble transforming growth factor－β1 recepterⅡ might inhibit transforming growth factor－β－induced myofibroblast differentiation and improve ischemic cardiac function after myocardial infarction in rats［J］.Coron Artery Dis，2010，21(6):369 －377.

［7］Sun Y，Zhang JQ，Zhang J，et al.Cardiac remodeling by fibrosis tissue after infarction in rats［J］.Lab Clin Med，2000，135(4):316－323.

［8］Ellmers LJ，Scott NJ，Medicherla S，et al.Transforming growth factor－beta blockade down－regulates the rennin－angiotensin system and modifies cardiac remodeling after myocardial infarction ［J］.Endocrinology，2008，149(11):5828－5834.

［9］Phatharajaree W，Phrommintikul A，Chattipakorn N.Matrix metalloproteinases and myocardial infarction［J］.Can J Cardiol，2007，23(9):727 －733.

［10］Anique D，Srefan F，Masanori A，et al.Targeted deletion of matrix metalloproteinase－9 attenuates left ventricular enlargement and collage accumulation after experimental myocardial infarction ［J］.J Clin Invest，2000，106(1):55－62.