血管緊張素Ⅱ和血管緊張素－(1－7)對大鼠血管平滑肌細胞腎素(原)受體表達的影響*

張娜娜， 李茂蓮， 邊云飛， 高 奮， 楊志明， 楊慧宇， 肖傳實

(山西醫科大學第二醫院心內科，山西 太原 030001)

腎素－血管緊張素系統(renin－angiotensin system，RAS)是機體維持正常血壓、水電解質平衡的重要系統。近年來，隨著越來越多生物活性血管緊張素肽以及與這些肽相互作用受體的發現，腎素血管緊張素系統越來越復雜。2002年Nguyen等［1］首次報道人腎素(原)受體［(pro)renin receptor，(P)RR］的存在，并且克隆了該受體。(P)RR在人體內廣泛分布，免疫細胞化學研究表明，(P)RR主要分布在遠端腎小管、腎小球系膜區、腎和冠脈血管的平滑肌細胞、新生大鼠的心肌細胞、人臍靜脈內皮細胞及人的單核細胞。自從(P)RR被發現以來，關于(P)RR在腎臟和心臟中的生理及病理作用越來越受到重視，特別是在糖尿病腎病和心肌梗死發病中的研究［2－4］。大量研究發現RAS參與了動脈粥樣硬化的發病過程［5，6］，抑制 RAS對治療心血管疾病具有良好效果。而血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang II)是RAS中的主要活性物質，血管緊張素－(1－7)［angiotensin－(1－7)，Ang－(1－7)］是 AngⅠ和 AngⅡ轉化而成的7肽生物活性物質，近年來研究發現其在許多方面與AngⅡ有著相拮抗的作用。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管組成的主要細胞，在動脈粥樣硬化形成、高血壓和血管再狹窄等疾病中起重要作用，故本研究將觀察AngⅡ和Ang－(1－7)對VSMCs(P)RR的調節，并進一步探討其機制。

材料和方法

1 材料

細胞培養基 DMEM、胎牛血清購自 Hyclone;A7r5細胞株購自上海中科院細胞庫;胰蛋白酶、AngⅡ、Ang－(1－7)和renin為Sigma產品;RNA抽提試劑盒購自Gibco;逆轉錄試劑盒購自MBI;內參照物GAPDH和(P)RR購自上海生工生物工程技術服務有限公司。SYBR Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa，(P)RR單克隆抗體購自Sigma，辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG購自Cell Signaling Technology，其它試劑均為國產分析純。

2 大鼠VSMCs的培養

A7r5細胞株用含20%FBS的DMEM培養基培養，培養瓶中置于5%CO2、37℃培養箱內培養，待細胞生長達亞融合狀態時，以0.25% －EDTA胰蛋白酶消化、傳代。選擇生長良好的第2－5代細胞用于實驗。

3 實驗分組

將生長在6孔培養板上和50 mL培養瓶中無血清靜止培養6 h的VSMCs培養液，按以下分組加入不同干預因素進行實驗。(1)對照組:不加干預因素;(2)不同濃度AngⅡ組:分別加入AngⅡ10、100、1000 nmol/L;(3)不同濃度Ang－(1－7)組:分別加入Ang－(1 －7)10、100、1000 nmol/L;(4)AngⅡ +losartan(AT1受體拮抗劑)組:losartan 10－6mol/L預處理30 min后，再加入AngⅡ 100 nmol/L;(5)AngⅡ+PD123319(AT2受體拮抗劑)組:先用PD12331910－5mol/L預處理30 min后，再用終濃度為100 nmol/L AngⅡ;(6)CGP42112A(AT2受體激動劑)組:加入10－7mol/L CGP42112A。

4 實時定量PCR檢測(P)RR mRNA表達

收集培養的細胞，應用RNA提取試劑盒提取RNA，并用紫外分光光度計進行檢測，其后取5 μL RNA按照反轉錄試劑盒制備cDNA后，以GAPDH作為內參照，采用SYBR Green法實時定量PCR檢測，反應為20 μL體系，包含上、下游引物、DNA模板、SYBR Premix Ex TaqTMII和dH2O。大鼠(P)RR上游引物5'－CATAAGCATCTCGCCAAGG －3'，下游引物5'－ACCAGGGATGTGTCGAATGA －3'，產物片段224 bp。GAPDH上游引物 5'－TGAACG GGAAGCTCACTGG －3'，下游引物 5'－ TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'，產物片段307 bp。定量反應條件:95℃10 min，然后95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，進行40個循環。各組PCR均重復3次。mRNA的相對表達量用 2－ΔΔCt方法來表示，其中 ΔCt=Ct目標mRNA－CtGAPDH，ΔΔCt= ΔCt處理－ ΔCt對照。

5 Western blotting檢測(P)RR蛋白的表達

收集培養的細胞，PBS洗滌2遍，收集細胞，加入1 mL細胞裂解緩沖液，4℃旋轉裂解30 min，12000 r/min離心15 min，收集上清。Bradford法測定蛋白質濃度，取60 μg的總蛋白經10%SDSPAGE膠電泳分離，常規方法轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBS－T溶液37℃封閉3 h后，加入(P)RR單克隆抗體(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜，用1×TBS溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗，室溫(1∶10000稀釋)4 h，1 ×TBS溶液洗膜 4 ×10 min。辣根過氧化物酶HRP－ECL發光法檢測，用凝膠成像系統拍照，用Lab－Work軟件進行灰度分析。各組實驗均重復3次。

6 統計學處理

實驗數據采用SPSS 13.0 For Windows軟件包進行統計，數據以均數±標準差()表示，各組均數進行單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

結 果

1 大鼠血管平滑肌細胞形態觀察

A7r5細胞株傳代后2－3 d細胞生長達亞融合狀態，顯微鏡下可見細胞呈梭形或長梭形，成束的細胞平行排列，表現出“峰－谷”狀生長，見圖1。

2 AngⅡ對VSMCs(P)RR mRNA表達的影響

與對照組比，不同濃度AngⅡ可以促進VSMCs(P)RR mRNA表達，并且呈濃度依賴性(均 P＜0.05);加入CGP42112A可以促進VSMCs(P)RR mRNA表達(P＜0.05)，加入PD123319可抑制(P)RR的VSMCs mRNA表達(P＜0.05)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR mRNA表達(P＞0.05)，見圖2。

3 Ang－(1－7)對VSMCs(P)RR mRNA表達的影響

與對照組比，不同濃度 Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表達(均P＜0.05)，各濃度之間比較無顯著差異(均P＞0.05)，見圖3。

Figure 1.The morphological observation of rat VSMCs.The cells showed a“hill and valley”growth pattern.A:×100;B:×200.圖1 大鼠血管平滑肌細胞

Figure 2.Effect of AngⅡon the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs AngⅡ group.圖2 AngⅡ處理各組細胞(P)RR mRNA的表達

Figure 3.Effects of Ang－(1－7)on the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 Ang－(1－7)處理各組細胞(P)RR mRNA的表達

4 AngⅡ對VSMCs(P)RR蛋白表達的調節

與對照組比，不同濃度AngⅡ可以促進VSMCs(P)RR蛋白的表達，并且呈濃度依賴性(P＜0.01);加入CGP42112A可以促進VSMCs(P)RR蛋白的表達(P＜0.01)，加入 PD123319可抑制 VSMCs(P)RR蛋白的表達(P＜0.01)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR蛋白的表達(P＞0.05)，見圖4。

5 Ang－(1－7)對VSMCs(P)RR蛋白表達的調節

與對照組比，不同濃度 Ang－(1－7)可抑制VSMCs(P)RR蛋白的表達(均P＜0.01)，各濃度之間比較無顯著差異(均P＞0.05)，見圖5。

Figure 4.Effect of AngⅡon the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs AngⅡgroup.圖4 AngⅡ處理各組細胞(P)RR受體蛋白的表達

Figure 5.Effect of Ang－(1－7)on the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖5 Ang－(1－7)處理各組細胞(P)RR受體的免疫印記結果

討 論

RAS是機體維持正常血壓、水電解質平衡的重要系統。近年來，(P)RR在心血管疾病中的作用越來越受到人們的關注。研究表明，腎素和腎素前體通過與(P)RR結合，可發揮不依賴于Ang II的生物學作用，使腎系膜細胞增殖［7］，平滑肌細胞增殖和遷移等［6］。

VSMCs異常增殖是動脈粥樣硬化斑塊形成、高血壓和血管成形術后再狹窄等血管增殖性疾病共同的細胞病理學基礎。在心血管系統中，VSMCs不僅是Ang II的一個重要來源，而且，也是Ang II調節血管功能的主要靶細胞。在生理或病理條件下，Ang II除直接作用于VSMCs，引發細胞收縮或增殖外，還可通過誘導VSMCs表達、釋放多種生物活性物質，產生一系列繼發效應。本研究發現，與對照組比，AngⅡ可以促進VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表達，并且呈濃度依賴性(均P＜0.05);加入AT2受體激動劑CGP42112A可以促進VSMCs(P)RR的mRNA和蛋白的表達，加入AT2受體拮抗劑PD123319可抑制(P)RR的 VSMCs mRNA和蛋白的表達(均 P＜0.01)，加入 AT1受體拮抗劑 losartan則不能抑制VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表達，故AngⅡ可能通過AT2受體上調(P)RR，從而促進平滑肌細胞增殖。

Ang－(1－7)是近年來發現的RAS又一新成員，主要由血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)分解 Ang Ⅱ所產生［7］。Ang －(1－7)在多種病理生理過程中拮抗AngⅡ，對于RAS過度激活所導致的病變，如高血壓、心力衰竭和動脈粥樣硬化等［8－10］起保護作用。亦有研究發現，Ang－(1－7)可抑制內膜損傷模型的中膜平滑肌細胞的增殖［11，12］，但其抑制 VSMCs增殖和遷移活性的分子機制至今未明。腎素和腎素前體通過與(P)RR結合，可促進平滑肌細胞遷移。本文通過用不同濃度的Ang－(1－7)干預血管平滑肌細胞，發現Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表達，各濃度之間比較無顯著差異，故Ang－(1－7)抑制平滑肌細胞增殖的作用可能部分是通過調節(P)RR實現的。

腎素(原)受體系統可產生不依賴于Ang II的生物學作用，使人們更加深入地認識RAS，將會為心、血管及腎臟疾病治療提供新的思路。

［1］Nguyen G，Delarue F，Burcklé C，et al.Pivotal role of the renin/prorenin receptor in angiotensinⅡproduction and cellular responses to renin［J］.J Clin Invest，2002，109(11):1417－1427.

［2］Batenburg WW，Krop M，Garrelds IM，et al.Prorenin is the endogenous agonist of the(pro)renin receptor.Binding kinetics of renin and prorenin in rat vascular smooth muscle cells overexpressing the human(pro)renin receptor［J］.J Hypertens，2007，25(12):2441 －2453.

［3］Saris JJ，'tHoen PA，Garrelds IM，et al.Prorenin induces intracellular signaling in cardiomyocytes independently of angiotensin II［J］.Hypertension，2006，48(4):564 －571.

［4］Ichihara A，Suzuki F，Nakagawa T，et al.Prorenin receptor blockade inhibits development of glomerulosclerosis in diabetic angiotensin II type 1a receptor－deficient mice［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(7):1950 －1961.

［5］Keidar S，Kaplan M，Gamliel－Lazarovich A.ACE2 of the heart:From angiotensin I to angiotensin(1－7)［J］.Cardiovasc Res，2007 ，73(3):463 －469.

［6］Liu G，Hitomi H，Hosomi N，et al.Prorenin induces vascular smooth muscle cell proliferation and hypertrophy via epidermal growth factor receptor－mediated extracellular signal－ regulated kinase and Akt activation pathway［J］.J Hypertens，2011，29(4):696 －705.

［7］He M，Zhang L，Shao Y，et al.Inhibition of renin/prorenin receptor attenuated mesangial cell proliferation and reduced associated fibrotic factor release［J］.Eur J Pharma-col，2009 ，606(1 －3):155－161.

［8］Grobe JL，Mecca AP，Mao H，et al.Chronic angiotensin－(1－7)prevents cardiac fibrosis in DOCA－salt model of hypertension［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(6):H2417 － H2423.

［9］Benter IF，Yousif MH，Cojocel C，et al.Angiotensin－(1－7)prevents diabetes－induced cardiovascular dysfunction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(1):H666－H672.

［10］梁 斌，楊志明，張娜娜，等.血管緊張素－(1－7)對血管緊張素Ⅱ誘導的臍靜脈內皮細胞MCP－1和ICAM－1表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(71):1319－1324.

［11］Strawn WB，Ferrario CM，Tallant EA.Angiotensin－(1－7)reduces smooth muscle growth after vascular injury［J］.Hypertension，1999，33(1 Pt 2):207 －211.

［12］Zeng W，Chen W，Leng X，et al.Chronic angiotensin－(1－7)administration improves vascular remodeling after angioplasty through the regulation of the TGF－β/Smd signaling pathway in rabbits［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，389(1):138－144.