肉桂醛抗腺病毒作用研究*

劉 蕾， 曲章義， 王淑秋， 魏鳳香， 高 虹

(1哈爾濱醫科大學公共衛生學院衛生微生物學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081;2佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007;3廣東藥學院生物學教研室，廣東 廣州 510006)

腺病毒(adenovirus，ADV)是一群分布十分廣泛的DNA病毒，可以感染呼吸道、腸道、眼睛、膀胱以及肝臟，引起人類呼吸道、胃腸道、泌尿系及眼的疾病并造成流行傳播，少數對動物有致癌作用，嚴重威脅著人類的健康［1，2］。目前，腺病毒感染主要是藥物治療，至今仍缺乏特異性強、副作用小的藥物。

肉桂醛是傳統中藥肉桂揮發油中的主要成分。近30年來的藥理學研究證實，它具有抗菌［3－5］、抗腫瘤［6，7］、抗突變［8］和促進內皮細胞增殖［9］等多種藥理作用，且毒副作用低。目前關于肉桂醛抗病毒作用方面的研究甚少［10］。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 肉桂醛、MTT和鼠抗腺病毒六鄰體(hexon)蛋白特異性單克隆抗體購于Sigma;胎牛血清和RPMI－1640培養液購于Invitrogen;二甲基亞砜購于上海菲達有限公司;FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體和多聚賴氨酸購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞株和病毒株 HeLa細胞株和ADV病毒株由哈爾濱醫科大學衛生微生物教研室保存。

2 方法

2.1 藥物配制 用RPMI－1640培養液將肉桂醛(25 g/L)按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280 比例進行倍比稀釋，0.22 μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存備用。

2.2 病毒培養液的制備及其毒力測定 取腺病毒液0.5 mL接種到已經培養成70%單層HeLa細胞的培養瓶中，37℃吸附120 min，加入含2%胎牛血清的RPMI－1640維持液1.5 mL，置37℃、5%CO2條件下培養，當HeLa細胞病變達75%以上時，反復凍融3次收集腺病毒液。以50%細胞培養感染量(50%cell culture infective dose，CCID50)表示病毒毒力。將病毒培養液做10倍系列稀釋從10－1－10－10。將各稀釋度的病毒液接種于單層HeLa細胞中，每一稀釋度8個復孔，同時設陰性對照，37℃培養3－5 d，觀察細胞病變(cytopathic effect，CPE)。用 Reed－Muench法求出CCID50。

2.3 肉桂醛對HeLa細胞毒性測定 將不同濃度的肉桂醛分別加入HeLa細胞已長成單層的96孔細胞培養板中，每個濃度重復8個復孔，同時設立正常細胞對照，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，連續觀察3 d，記錄細胞形態變化。培養結束前4 h，吸棄培養板中液體，PBS沖洗3次，用MTT法檢測細胞活力。實驗重復3次。

2.4 藥物抗病毒的不同作用方式

①對腺病毒的直接滅活作用 在藥物無毒范圍內，不同濃度的肉桂醛分別與100CCID50腺病毒液等量混合，37℃作用2 h后，將其接種在HeLa細胞已長成單層的96孔細胞培養板中，37℃吸附2 h后，棄上清，加維持液200 μL，每一濃度設8個復孔，實驗同時設細胞對照和病毒對照，置于5%CO2、37℃孵箱培養。每天觀察CPE。當病毒對照細胞病變達75%以上，用MTT法檢測細胞活力。

②在生物合成階段對腺病毒的作用 在長成單層HeLa細胞的96孔板上，每孔接種20 μL 100CCID50腺病毒病毒液，37℃吸附2 h，棄病毒液。在藥物無毒范圍內加入不同濃度的肉桂醛，每孔200 μL，每一濃度設8個復孔，實驗同時設細胞對照和病毒對照，余方法同①。

③對腺病毒吸附的作用 在藥物無毒范圍內，不同濃度的肉桂醛分別與100CCID50腺病毒病毒液等量混合后，立即加到已長成單層HeLa細胞的96孔細胞培養板中，37℃吸附2 h后，棄去96孔板中液體，加維持液200 μL，每一濃度設8個復孔，實驗同時設細胞對照和病毒對照，余方法同①。

④對細胞的保護作用 在藥物無毒范圍內，每孔細胞預先加入不同濃度的肉桂醛200 μL，37℃作用4 h后用PBS洗滌3次，每孔再加入100CCID50腺病毒，吸附2 h，棄病毒上清，加維持液200 μL，每一濃度設8個復孔，實驗同時設細胞對照和病毒對照，余方法同①。

2.5 MTT法細胞存活率/活力的測定 經PBS沖洗3次后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，于37℃培養箱中培養4 h，去上清后每孔加DMSO 200 μL，微量振蕩器振蕩5 min，酶標讀數儀比色(波長490 nm)測吸光度(absorbance，A)值。

HeLa細胞存活率(%)=藥物組A值/細胞對照組A值×100%。

2.6 病毒增殖抑制實驗 將濃度為1×108/L HeLa細胞懸液加入96孔細胞培養板，每孔200 μL，置37℃ 5%CO2條件下培養18 h，使細胞生長成單層。肉桂醛(0.0195 g/L)組細胞反復凍融3次，合并同一劑量重復孔(6孔)，取1 mL病毒懸液離心后取0.1 mL上清，按10倍系列稀釋，從10－1－10－10。將各稀釋度的病毒液0.1 mL接種于單層HeLa細胞，37℃作用1 h，各孔再加入維持液0.1 mL，每一稀釋度設8個復孔，同時設陰性對照，37℃、5%CO2條件下培養 3－5 d，用 Reed－Muench法求出CCID50。判定標準以加藥組比病毒對照組的CCID50降低1 個對數(ΔlogCCID50)以上為有效［11］。

2.7 病毒六鄰體蛋白表達的激光共聚焦熒光分析

高壓并滴加多聚賴氨酸的玻片置于24孔培養板，接種HeLa細胞，24 h后細胞長成單層，密度在70%－80%。最大無毒濃度肉桂醛4種作用方式處理樣本，4%多聚甲醛固定30 min，加入1∶100稀釋(用PBST稀釋)的鼠抗 ADV六鄰體蛋白抗體50 μL，37℃孵育1 h。PBST洗滌3次，每次5 min，去離子水浸泡洗1 min，加入1∶50稀釋(用PBST稀釋)的FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育30 min。PBST浸泡洗3次，每次3 min，去離子水浸泡洗1 min，室溫晾干玻片后甘油與PBS(9∶1)封片。激光掃描共聚焦顯微鏡取圖，每個試樣隨機選擇30個細胞測量細胞熒光強度。

3 統計學處理

數據用SAS 9.13軟件處理。用Linear Regression方法計算半數有效濃度(IC50)，并對藥物劑量與其產生的效應進行相關性分析，判斷是否存在量效關系。組間比較采用方差分析。

結 果

1 病毒毒力測定

用普通光學顯微鏡觀察CPE情況，與正常細胞組相比，腺病毒感染的HeLa細胞變圓，細胞彼此相連呈典型的葡萄串樣改變。當50%細胞出現病變時，視為CPE陽性細胞;72 h未出現細胞病變的接種細胞視為CPE陰性細胞。采用Reed－Muench法計算ADV培養液在HeLa細胞中的毒力為108.95CCID50/L，實驗中病毒攻擊量為106CCID50/L。

2 肉桂醛對HeLa細胞的毒性作用

肉桂醛對HeLa細胞的毒性作用表現為細胞增殖緩慢、顆粒較多、折光性強、形態改變、部分細胞破碎脫落等。該作用隨著藥物濃度的降低而降低，細胞活力逐漸增加。由圖1可知肉桂醛的最小毒性濃度是0.319 g/L。

Figure 1.The viability of HeLa cells incubated with different concentrations of cinnamaldehyde.圖1 不同濃度肉桂醛對HeLa細胞活力影響

3 肉桂醛的抗ADV致CPE活性

光鏡下觀察可見正常細胞對照組細胞培養液清亮，細胞呈多邊形或菱形，排列整齊緊密，胞漿清楚;病毒對照組HeLa細胞CPE表現為:細胞出現空泡，細胞腫脹、變圓、細胞間融合、脫落、細胞呈典型葡萄串狀，最后壞死脫落;而藥物作用組(除對細胞保護作用方式外)形態明顯偏正常，僅有部分細胞出現病變的特征，呈皺縮狀，或串狀或重疊或脫落;多數細胞呈正常的上皮形態。MTT實驗結果表明，在3種作用方式(除細胞保護作用方式外)下，無毒范圍內(0.0195－0.3125 g/L)的肉桂醛能夠增加宿主HeLa細胞存活率，且細胞存活率與藥物濃度呈正相關，見表1。這說明肉桂醛在3種作用方式(除細胞保護作用方式外)下能抑制ADV的致CPE作用。在細胞保護作用方式下，藥物作用組出現細胞典型的CPE，與病毒對照組無差別，宿主HeLa細胞存活率和病毒滴度與病毒對照組差異無顯著(P＞0.05)，說明肉桂醛對ADV感染無預防作用。

表1 肉桂醛抑制ADV的致細胞病變作用Table 1.Cinnamicaldehyde inhibited the cytopathic effect of ADV－induced cells(MTT assay)(%..n=8)

表1 肉桂醛抑制ADV的致細胞病變作用Table 1.Cinnamicaldehyde inhibited the cytopathic effect of ADV－induced cells(MTT assay)(%..n=8)

3.2 36.2 ±3.5 30.6 ±2.7 Biosynthesis 74.7±7.7 64.2±7.2 57.1±6.4 46.1±4.4 40.8±3.3 Adsorption 82.7±8.7 77.7±8.2 72.8±6.5 55.6±5.3 44.5±3.5 Protection Direct inactivation 69.6±5.8 57.9 ±4.2 45.8±—————

4 肉桂醛的抑制病毒增殖作用

肉桂醛治療組(除細胞保護方式外)病毒滴度分別 為 107.40CCID50/L、107.78CCID50/L 和 107.23CCID50/L，與病毒對照組(病毒滴度為108.95CCID50/L)比較均下降，且肉桂醛(除細胞保護作用方式外)組與病毒對照組相比ΔlogCCID50分別為1.55、1.17和1.72，均降低1個對數，見表2，說明肉桂醛在3種作用方式下(除對細胞保護作用方式外)可以降低腺病毒病毒滴度，從而具有抑制腺病毒增殖作用。

表2 肉桂醛對感染細胞中ADV增殖的影響Table 2.The effect of cinnamaldehyde(0.0195 g/L)on the proliferation of ADV in infected cells(CCID50assay)

5 六鄰體蛋白表達的激光共聚焦熒光定量分析

激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示除HeLa細胞對照組(圖2A)外，其它組細胞內均可見不同強度的綠色熒光，見圖2B－F。熒光定量統計結果顯示，肉桂醛(除細胞保護作用方式外)組熒光強度明顯低于病毒對照組，差異顯著(P＜0.05);而肉桂醛細胞保護作用方式組熒光強度與與病毒對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，見表3。實驗結果表明在3種作用方式(直接滅活階段、病毒復制階段和病毒吸附階段)下肉桂醛可抑制ADV六鄰體蛋白的表達。

表3 肉桂醛對感染細胞中ADV六鄰體蛋白表達的影響Table 3.The effect of cinnamaldehyde on the expression of ADV hexon protein in infected cells(.n=30)

表3 肉桂醛對感染細胞中ADV六鄰體蛋白表達的影響Table 3.The effect of cinnamaldehyde on the expression of ADV hexon protein in infected cells(.n=30)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs ADV control group.

Group Expression of ADV hexon protein ADV control 135.10 ±12.20 Direct inactivation 93.59 ±7.93*Biosynthesis 86.70 ±5.54＊＊Adsorption 65.56 ±3.65＊＊Protection 129.40 ±9.50

討 論

腺病毒感染十分普遍，引起多種疾病，是兒童呼吸道感染的主要病原之一，以3、5、7型為主，多引起急性咽結膜熱，6個月至3歲之間的兒童還易發展成嚴重肺炎［12］，個別型別的腺病毒還會引起細胞轉化，甚至致癌［13］。腺病毒的傳染性很強，尤其是在人口密集的地方，對免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通過飛沫和接觸傳染，在同一時期可造成區域性流行或暴發流行［14－16］。

Figure 2.The effect of cinnamaldehyde on the expression of ADV hexon protein in cells(immunofluorescence assay).A:HeLa cells;B:HeLa cells infected with ADV;C:ADV inactivaed directly by cinnamaldehyde;D:cinnamaldehyde inhibiting the viral biological synthesis of ADV;E:cinnamaldehyde preventing the absorption of ADV;F:cinnamaldehyde protecting HeLa cell from ADV infection.圖2 肉桂醛對細胞內ADV六鄰體蛋白表達的影響

病毒是一類結構簡單，無細胞裝置，大部分缺乏酶系統，只能依賴宿主細胞進行復制和增殖。它一方面干擾宿主細胞的代謝，另一方面又深藏于細胞內不易為一般藥物所消滅［17］。由于病毒只能在宿主細胞內增殖，因而要求抗病毒藥物既能穿入細胞，選擇性地抑制病毒的增殖，又不損傷宿主細胞。

傳統中藥以其資源豐富、多靶點作用機制、較少不良反應、無耐藥性等優點表現出誘人的應用前景［18］。

肉桂皮中大部分是易揮發性的物質，主要為肉桂醛，本實驗首先通過CPE方法和MTT方法檢測肉桂醛抗腺病毒的效果及其對宿主細胞的毒副作用。CPE方法結果顯示肉桂醛治療組(對病毒的直接滅活作用方式;對病毒復制增殖的抑制作用方式;對病毒吸附的抑制作用方式)細胞形態明顯偏正常，僅有部分細胞出現病變特征，呈皺縮狀，或串狀或重疊或脫落，多數細胞呈正常上皮形態，而細胞保護方式肉桂醛組細胞出現空泡，細胞腫脹、變圓、細胞間融合、脫落、細胞呈典型葡萄串狀CPE病變，與病毒組沒有差別。MTT和病毒滴度實驗結果也發現，在肉桂醛治療組(除細胞保護方式外)宿主細胞存活率增高，病毒滴度下降，且細胞存活率與藥物的濃度呈正相關;細胞保護方式肉桂醛組宿主細胞存活率和病毒滴度與病毒對照組差異無顯著(P＞0.05)。上述實驗結果表明肉桂醛能直接殺傷病毒，明顯抑制腺生物合成和病毒的吸附，但是對病毒侵入細胞無預防作用。

腺病毒粒具有252個殼粒，其中二十面的頂角殼粒為12個五鄰體(penton)，1個基底(base)。除五鄰體外還有240個非頂角殼粒，稱為六鄰體(hexon)，是六鄰體蛋白的同源三聚體，帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇［19］。為研究肉桂醛抗ADV作用機制，我們通過免疫熒光法檢測六鄰體蛋白的表達，結果肉桂醛治療組(除細胞保護方式外)與病毒對照組相比六鄰體蛋白表達減低。這說明肉桂醛可能通過抑制ADV六鄰體蛋白表達而具有直接殺傷病毒、抑制病毒的生物合成和吸附的作用。

本研究主要針對肉桂醛在體外的抗腺病毒作用，但由于藥物進入機體后可能與血漿蛋白或組織蛋白結合，或經肝臟酶代謝等一系列復雜的藥代動力學過程，才發揮其生物學作用，因此其抗病毒作用還需要在動物實驗和臨床上進一步驗證。

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