IL-17R在韋格納肉芽腫患者外周血免疫細胞的表達

姜 波,王 紅,劉布駿

(南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院風濕免疫科,江蘇南京,210008)

韋格納肉芽腫(WG)為一種累及全身多個器官包括上/下呼吸道和腎臟系統的壞死性肉芽腫血管炎,盡管在我國發病率不高,但嚴重影響患者的生活質量及生存率。目前,WG的病理機制尚不明確。近年來研究發現,新的T細胞亞群-IL-17產生細胞(Th17)在很多自身免疫病中有重要的參與作用。Th17不同于Th1和Th2,產生標志性的細胞因子IL-17,與細胞的表面受體-IL-17RA/RC結合,誘導中性粒細胞的募集及淋巴細胞的浸潤和活化而參與免疫反應。已發現IL-17在類風濕關節炎[1]、多發性硬化[2]、系統性紅斑狼瘡[3]、大動脈炎[4]和炎性腸病[5]患者中的表達顯著升高。Abdulahad等研究表明,與正常人相比,WG患者外周血Th17(IL-4、IL-17、IFN-γ)比例顯著升高,WG的自身抗原-胰蛋白酶3(PR3)刺激后,ANCA陽性患者外周血Th17的比例顯著升高,提示IL-17參與WG的病理損害,且與ANCA的產生相關[6],但具體機制不明?？紤]到WG的血管炎損傷主要由循環中大量的自身抗體PR3-ANCA介導,后者由B細胞分化的漿細胞產生。在其他自身免疫病如系統性紅斑狼瘡中,已證實IL-17與自身抗體-抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體[7]和抗組蛋白抗體[8]的產生相關。因此WG患者體內Th17產生的IL-17可能通過與其下游B細胞表面IL-17受體-IL-17R結合后誘導后者產生自身抗體-ANCA而發揮病理作用。至今IL-17R在WG患者體內特別是淋巴細胞上的表達尚無相關研究。本實驗將通過檢測IL-17R在WG患者外周血免疫細胞包括中性粒細胞(PMN)、單核細胞(Mono)、總淋巴細胞(Lym),特別是B淋巴細胞和漿細胞上的表達有無異常,探索WG的病理機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

20例符合1990年美國風濕病學會(ACR)分類標準的WG患者,6例為非活動期患者,伯明翰血管炎活動性評分BVAS3[9]=0分。14例活動期患者,BVAS3均大于 0分,其中環磷酰胺(Cyc)治療組6例,甲氨喋呤(MTX)治療組8例。20例性別和年齡相匹配的正常人(HC)作為對照。

1.2 試劑

流式細胞儀所用熒光標記的小鼠抗人單抗如下:APC標記的抗IL-17R和同型對照IgG1,FITC標記的抗CD38、FITC標記的抗 CD20和同型對照IgG1,PE標記的抗CD19同型對照IgG1,以及紅細胞裂解液,均購自BD Pharmigen公司。

1.3 流式細胞儀檢測IL-17R表達

取5 mL EDTA抗凝的靜脈血,1 200轉/min室溫離心10 min,PBS洗滌3次。細胞沉淀以100 μ L PBS重懸,分別加入流式抗體APC-抗IL-17R+PE-抗FITC-抗CD38,APC-抗 IL-17R+PE-抗FITC-抗 CD20,同型對照APC-IgG1+PE-IgG1+FITCIgG1,4℃避光孵育30 min。1.5 mL紅細胞裂解液在4℃避光孵育10 min,1 200轉/min 4℃離心10 min,棄上清,細胞重懸于500 μ L流式緩沖液中。FACS Calibur(BD Bioscience)流式細胞儀檢測,CellQuest軟件分析數據。

2 結 果

2.1 比較IL-17R在WG患者和正常人外周血免疫細胞上的表達

流式細胞儀檢測了IL-17R在WG患者(n=20)和正常人(n=20)外周血PMN、單核細胞、總淋巴細胞、B淋巴細胞漿細胞上的表達。結果發現,IL-17R在WG患者和正常人PMN、單核細胞、總淋巴細胞上的表達無顯著差異,但在WG患者B淋巴細胞(P<0.05)和漿細胞(P<0.05)上的表達顯著高于正常人。

2.2 比較IL-17R在活動期與非活動期WG患者外周血免疫細胞上的表達

根據BVAS3評分將WG患者分為活動期(n=14,BVAS3>0分)與非活動期(n=6,BVAS3=0分),流式細胞儀比較了IL-17R在2組患者外周血免疫細胞包括B淋巴細胞以及漿細胞上的表達。結果發現,活動期與非活動期WG患者中性粒細胞、單核細胞和總淋巴細胞表面 IL-17R的表達無差異,與非活動期患者相比,活動期患者IL-17R在B淋巴細胞及漿細胞上的表達有下降趨勢,但在統計學上無顯著差異。

2.3 比較IL-17R在CyC與MTX治療組WG患者外周血免疫細胞上的表達

流式細胞儀比較了IL-17R在Cyc(n=6)和MTX(n=8)治療組患者外周血中性粒細胞、單核細胞、總淋巴細胞、B淋巴細胞及漿細胞上的表達。結果發現,對于各種免疫細胞包括不同發育階段B細胞,IL-17R的表達在2個治療組間均無顯著性差異,見表1。

表1 IL-17R在各治療組WG患者外周血免疫細胞上的陽性率(%)

3 討 論

IL-17的生理功能主要是作為促炎因子發揮作用,例如刺激IL-6、一氧化氮和前列腺素E2(PGE2)的產生[10],還可協同其他炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和IFN-γ[11]等加劇及放大局部炎癥反應,以及介導中性粒細胞和單核細胞趨化至炎癥部位[12]。研究發現IL-17參與很多自身免疫病[1-5],其作用機制不明,可能與其誘導自身抗體產生相關[7-8]。David等研究發現,在腎小球腎炎模型鼠-BXD2中,IL-17可直接作用于生發中心的B細胞,促進其發育、遷移及分化為抗體產生細胞[13]。IL-17在韋格納肉芽腫病理機制中的參與作用尚屬初步探索階段。如前所述,WG患者體內外周血中Th17及IL-17增多,自身抗體ANCA陽性的患者Th17升高更為明顯[6],故推測IL-17可能誘導漿細胞產生ANCA。因此,有必要檢測WG患者體內不同發育階段的B淋巴細胞特別是漿細胞表面IL-17受體-IL-17R的表達是否存在異常。

作者實驗發現,IL-17R在WG患者外周血B淋巴細胞及漿細胞表面的表達顯著高于正常人,提示與正常人相比,IL-17對WG患者B細胞發育的初始階段及分化為抗體產生細胞終末階段的作用均顯著增強,這與WG患者體內增多的Th17比例及 IL-17濃度一致,即Th17通過產生IL-17與B細胞表面IL-17R相互作用,進一步啟動下游信號如抗體產生等參與WG發病。有趣的是,活動期WG患者B淋巴細胞及漿細胞表面IL-17R的表達并不高于非活動期患者,甚至有下降趨勢,原因尚不明確,可能的機制為活動期患者為控制病情,采用較強的免疫抑制劑聯合治療,甚至使用藥物的沖擊劑量,而緩解期患者多采用一種緩和的免疫抑制劑維持,免疫抑制劑的藥理作用可能抑制了B淋巴細胞表面 IL-17R的表達,這尚需進一步實驗確定。

因IL-17還可誘導中性粒細胞和單核細胞趨化至炎癥反應部位,作者還比較了IL-17R在WG患者和正常人群的這2種細胞表面的表達。結果發現,無論是WG患者和正常人之間,還是活動期與非活動期WG患者間,IL-17R在中性粒細胞和單核細胞的表達均無顯著差異,提示IL-17可能通過其他途徑參與WG的炎癥進展。

為探索不同治療藥物對IL-17R的影響,作者還檢測了WG常用的免疫抑制劑-環磷酰胺和甲氨蝶呤治療組外周血中性粒細胞、單核細胞和B淋巴細胞、漿細胞上IL-17R的表達。結果顯示,兩個治療組間無明顯差異,提示在這兩種免疫抑制劑的療效差異中,IL-17R的表達并非決定因素。

[1] Chabaud M,Durand J M,Buchs N,et al.Human interleukin-17:a T cell derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium[J].Arthritis Rheum,1999,42:963.

[2] Lock C,Hermans G,Pedotti R,et al.Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis[J].Nat Med,2002,8:500.

[3] Wong C K,Ho C Y,Li E K,et al.Elevation of proinflammatory cytokine(IL-18,IL-17,IL-12)and Th2 cytokine(IL-4)concentrations in patients with systemic lupus erythematosus[J].Lupus,2000,9:589.

[4] Sohn M H,Noh S Y,Chang W,et al.Circulating interleukin 17 is increased in the acute stage of Kawasaki disease[J].Scand J Rheumatol,2003,32:364.

[5] Fujino S,Andoh A,Bamba S,et al.Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease[J].Gut,2003,52:65.

[6] Abdulahad W H,Stegeman C A,Limburg P C,et al.Skewed distribution of T h17 lymphocytes in patients with Wegener′s granulomatosis in remission[J].Arthritis Rheum,2008,58:2196.

[7] Dong G,Ye R,Shi W,et al.IL-17 induces autoantibody overproduction and peripheral blood mononuclear cell overexpression of IL-6 in lupus nephritis patients[J].Chin Med J,2003,116:543.

[8] Hsu H C,Yang P A,Wang J,et al.Interleukin 17-producing T helper cells and interleukin 17 orchestrate autoreactive germinal center development in autoimmune BXD2 mice[J].Nat Immunol,2008,9:166.

[9] Mukhtyar C,Lee R,Brown D,et al.Modification and validation of the Birmingham Vasculitis Activity Score(version 3)[J].Ann Rheum Dis,2009,68:1827.

[10] Fossiez F,Djossou O,Chomarat P,et al.T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines[J].J Exp Med,1996,183:2593.

[11] Albanesi C,Cavani A,Girolomoni G.IL-17 is produced by nickelspecific T lymphocytes and regulates ICAM-1 expression and chemokine production in human keratinocytes:synergistic or antagonist effects with IFN-gamma and TNF-alpha[J].J Immunol,1999,162:494.

[12] Miyamoto M,Prause O,Sjostrand M,et al.Endogenous IL-17 as a mediator of neutrophil recruitment caused by endotoxin exposure in mouse airways[J].J Immunol,2003,170:4665.

[13] T arlinton D.IL-17 drives germinal center B cells[J].Nat Immunol,2008,9:124.