三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株抗增殖及誘導凋亡作用的研究

朱慕云,姜正華,葛 輝,李 梅,胡茂志

(1.揚州大學臨床醫學院呼吸科;2.揚州大學實驗中心,江蘇揚州,225001)

三氧化二砷(As2O3)是一種有毒的化合物,但低劑量 As2O3除作為一種有效的中藥治療牛皮癬、梅毒和類風濕性關節炎等多種疾病外,近年來的研究表明三氧化二砷具有抗腫瘤作用。本研究探討了三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株的生長抑制及誘導腫瘤細胞凋亡的作用,現報道如下。

1 材料與方法

三氧化二砷制劑(伊泰達),由哈爾濱伊達藥業提供;二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于上海華美公司;SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株、RPMI-1640培養基及胰蛋白酶購于中國科學院上海生物細胞研究所;Annexin V:FITC Apoptosis detection kit及 FACSAria流式細胞儀:均為美國 Beeton Dickinson公司。

細胞培養:將 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株培養于 37℃含 5%CO2溫箱內,使用 RPMI-1640培養液(含 15%小牛血清,青鏈霉素各 100 U/mL,L-谷氨酰胺200mg/L)培養,肺癌細胞呈貼壁生長,2～3 d后用 0.25%胰蛋白酶消化傳代。

實驗分組:實驗共設 3組,分別為空白組(加培養基 200μL),對照組(單細胞懸液 100μL+培養基 100μL,實驗組(單細胞懸液100μL+處理因素 100μL)。

癌細胞生長抑制率的測定:將消化計數的單細胞懸液加入 96孔培養板中,調節細胞濃度為 1×105個/mL,采用MTT法,每孔加入單細胞懸液100μL,三氧化二砷制劑 100μL,濃度分別為每毫升 0.1 μg、0.4 μg、0.8 μg、1 μg、4 μg及 8μg,置 37℃、5%CO2培養箱中培養 24 h后,每孔加入 40μL MTT液(5 mg/mL),繼續培養 4 h后,吸取上清液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL/孔,振蕩 10 min,使 MTT還原產物完全溶解,用ClinBio120型酶標儀,測定每孔光密度值(A570)。腫瘤細胞的生長抑制率(%)=(1-實驗組 A值/對照組 A值)×100%

細胞凋亡的形態學變化:將消化計數的單細胞懸液加入 96孔培養板中,調節細胞濃度為 1×105個 /mL,每孔加入單細胞懸液 100μL和 1μg濃度的三氧化二砷制劑 100μL。分別在 12、24及 48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及細胞數的改變。

細胞凋亡的檢測(Annexin V/PI標記法):將培養至對數生長的 SPCA/Ⅰ細胞裝入 96孔板,調節細胞濃度為 1×105個/孔。隔夜培養后,分別加入終濃度為 0.4、4μg/mL的三氧化二砷制劑。再培養 24 h后收集細胞,離心機 1 500 r/min,離心 5 min并給予冷 PBS洗滌,用 Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I進行標記后,避光染色15 min,上流式細胞儀檢測分析。

2 結 果

2.1 三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞有直接的抗增殖效應

將不同濃度的三氧化二砷(分別為 0.1、0.4、0.8、1.0、4.0和 8.0 μg/mL)作用于 SPCA/Ⅰ細胞 24 h后,進行 SPCA/Ⅰ細胞增殖抑制率的中位值檢測,結果分別為:6.78%、16.34%、37.13%、56.26%、70.32%和 97.55%。見圖 1。

2.2 細胞凋亡的形態學變化

圖1 不同濃度的三氧化二砷對人肺癌細胞生長的抑制作用

將 1μg/mL的 As2O3作用于 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞,分別在作用 12、24和 48 h后經倒置顯微鏡觀察并攝像,與對照組比較,細胞出現明顯的形態學變化,表現為細胞胞漿固化,細胞核不規則,染色質濃縮;體積縮小變圓,部分核碎裂,胞質和細胞膜分離,出現空泡,細胞裂解等細胞凋亡的特征性改變,并與所作用的時間成正比。

2.3 三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞誘導凋亡的作用

采用Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I進行標記、流式細胞儀檢測分析法,將 0.4μg/mL和 4μg/mL濃度的三氧化二砷作用于 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞 24 h后,計算出凋亡陽性細胞百分率分別為 17.8%和 28.6%,與對照組相比(3.3%)有顯著差異(P<0.01)。表明三氧化二砷有誘導 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞凋亡的作用(圖 2)。

結果判定:在雙變量流式細胞儀的散點圖 Q1-Q4象限上,Q3顯示活細胞(Annexin V-/PI-),Q2象限顯示非活細胞(Annexin V+/PI+),即凋亡晚期繼發死亡細胞或壞死細胞,右下象限顯示為凋亡細胞(Annexin V+/PI-)。

3 討 論

凋亡是機體消除多余或有潛在危險細胞的生理現象,以維持機體細胞總數在適當的生理范圍內。腫瘤不僅是細胞增殖、分化異常的結果,同時還是一種細胞凋亡調控障礙的疾病。凋亡受阻將導致細胞代謝的紊亂及腫瘤的發生和發展,是惡性腫瘤發生發展中的一個重要因素[1]。惡性腫瘤細胞凋亡的比例明顯下降,如能誘導腫瘤細胞凋亡比例的增加,則有可能抑制惡性腫瘤的發生和發展[2-3]。

圖2 AnexinV:PI標記檢測三氧化二砷(0.4、4.0μg/mL)對SPCA-1人肺腺癌細胞凋亡的影響

三氧化二砷(As2O3)是一種砷化物,俗稱砒霜,是一種有毒的化合物。但是,小劑量 As2O3具有抗癌活性,臨床治療急性早幼粒細胞白血病(APL)已有近 40年歷史,且已被美國食品和藥物管理局批準用于治療全反式維甲酸(ATRA)耐藥的 APL。近年來應用 As2O3治療人類腫瘤性疾病已成為腫瘤治療領域的一大研究熱點,國內外的一些研究顯示,三氧化二砷對胃癌、結腸癌細胞、膀胱癌及喉癌等實體瘤[3-6]也有一定的療效。三氧化二砷抗腫瘤作用的機理,目前認為可能有以下幾個方面:細胞毒作用,誘導腫瘤細胞凋亡,調節腫瘤細胞增殖周期,影響腫瘤血管生成,逆轉癌癥細胞耐藥等[6-8]。

本研究初步探討了 As2O3對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞抗增殖效應和誘導凋亡的效應,并分析了不同時間及不同濃度組 As2O3的作用。結果表明:不同濃度組的三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞的生長均有一定的抑制作用,其抑制程度和藥物濃度呈正相關。通過倒置相差顯微鏡發現癌細胞產生了細胞胞漿固化,細胞核不規則,染色質濃縮;體積縮小變圓,部分核碎裂,胞質和細胞膜分離,細胞裂解等細胞凋亡的特征性改變。通過 Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I進行標記、流式細胞儀檢測分析,在雙變量流式細胞儀的散點圖上發現不同濃度組的三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞均有誘導凋亡的作用,并隨著藥物濃度的增加,凋亡率也相應增加。

[1] 胡 穎,許凱黎.細胞凋亡機制研究的新進展[J].腫瘤,2001,21(5):389.

[2] 周彩存,梁 波.肺癌凋亡障礙機制及修復的研究進展[J].國際呼吸雜志,2006,26(2):122.

[3] Han Y H,Kim S Z,KIM S H,et al.Intracellular GSH level is a factor in As4.1 Jnxtanglomerular cell death by arsenic trioxide[J].J Cell Biocbem,2008,104(3):995.

[4] 劉 敦,蘇 凱,夏鐵男.三氧化二砷對人喉癌細胞株增殖抑制作用的探討[J].吉林醫學,2010,31(5):604.

[5] 劉天佑,薄挽瀾,宋 燕,等.三氧化二砷對人結腸癌細胞和 COX-2表達影響的研究[J].哈爾濱醫科大學學報,2010,44(4):355.

[6] Wang H,An R,Dong X,et al.Pretein Kinase Cis involved in arsenic trioxide-induced apoptosis and inhibition of proliferation in bladder cancer cells[J].Urol Int,,2009,82(2):214.

[7] Xiao Y F,lin S X,Wu DD,et al.Inhibitory effect of arsenic trioxide on angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor in gastric cancer[J].World J Gastroentero,2006,12(6):5780.

[8] 黃 勇,宋 勇,秦叔逵.三氧化二砷對人肺腺癌 A549細胞株生長及對 Survivin基因表達的影響[J].臨床腫瘤學雜志,2007,12(7):486.