H9亞型禽流感病毒TAQMAN探針熒光定量PCR檢測方法的建立

邰鏑 覃健萍 劉 闖 劉 軍,2

（1 廣東溫氏食品集團有限公司 廣東新興 527400 2 華南農業大學動物科學學院 廣州 510642）

禽流感病毒 (avian influenza virus，AIV)為單股負鏈RNA病毒，由8個獨立的RNA節段組成，根據其致病性強弱，可分為高致病性AIV和溫和型AIV[1]。其中H9N2亞型AIV為中低致病力毒株，分布廣泛，傳播迅速，臨床上可引起輕微呼吸道及產蛋下降等癥狀，同時能造成宿主的免疫抑制而繼發感染其他病原微生物，加劇病情。但由于溫和型AI在臨床癥狀上同新城疫、傳染性喉氣管炎和傳染性支氣管炎等傳染病及普通的呼吸道疾病癥狀極為相似，往往導致誤診或診斷不及時進而造成疫病迅速擴散，嚴重危害養禽業的發展。為了能及時確診H9N2亞型禽流感，以便采取相應的防控措施，防止疫情擴散，急需建立一種方便快捷的檢測方法，以滿足生產的需要。為此，本試驗建立了H9N2亞型禽流感Taqman探針熒光定量PCR檢測方法(RRT-PCR)，并與傳統RT-PCR方法進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 禽流感H9N2亞型病毒A/chicken/Guangdong/LYQ/2011（GenBank:JF715028.1）由華南農業大學動物科學學院保存；新城疫病毒(NDI系)、傳染性支氣管炎(IB)H120弱毒疫苗由廣東大華農動物保健品股份有限公司生產；傳染性喉氣管炎(ILT)弱毒疫苗由梅里亞動物保健有限公司生產。

1.1.2 儀器與試劑 7500型實時熒光定量PCR擴增儀為美國ABI公司生產；Eppendorf分光光度計（德國）；PCR Super Mix-UDG購自Invitrogen公司；質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；RNA PCR Kit(AMV)試劑盒與PMD19-T載體均由寶生物工程（大連）有限公司提供。

1.1.3 引物和寡核苷酸熒光探針的設計 GenBank數據庫中注冊的2400個HA基因核苷酸序列，用ClustalX與MEGA 4.0軟件進行同源性分析比較，選出高度保守且特異的核苷酸區域，用Primer Express 3.0設計1對特異性引物HA-up與HA-low和1個特異TaqMan探針HA-probe，引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成，探針5'端標記的熒光報告基團為FAM，3'端標記的熒光淬滅基團為TAMRA，具體見表1。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取及反轉錄 參照RNAzol的使用說明書方法提取病毒RNA作為RT-PCR模板用于反轉錄試驗或置于-80℃保存備用。參照AMV反轉錄酶使用說明書對RNA進行反轉錄，反轉錄引物為Uni12。

1.2.2 RRT-PCR反應體系與優化 RRT-PCR 25μL反應體系為 PCR Super Mix-UDG 12.5ul，ROX 0.05μL，HA-up 0.25μL，HA-low0.25μL，HA-probe 0.15μL，H2O 9.8μL，cDNA 2μL。PCR 反應程序為：50℃ 2min，95℃ 2min，然后 95℃ 3s，60℃30s共45個循環。熒光信號的收集及數據的采集定于60℃。檢測結束后，根據噪聲情況設定和調整基線及閾值，根據熒光曲線和Ct值初步判斷結果。同時用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析驗證熒光PCR擴增產物的特異性和擴增效率。采用矩陣法對引物濃度、探針濃度進行最佳配比篩選，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值(△Rn)。

1.2.3 重組質粒的構建 利用P1與P2引物對病毒HA基因進行擴增，獲得390bp產物，使用PMD19-T克隆載體與PCR產物連接，并轉化到DH5α株感受態細胞。提取質粒進行PCR鑒定和測序鑒定。測定質粒OD260和OD280，OD260/OD280在1.8～2.0之間可用作標準品。通過OD260值計算質粒濃度并換算成拷貝數/μL。計算公式如下:拷貝數(拷貝/μL)=質粒濃度(g/μL)×阿氏常數/質粒分子量。

1.2.4 標準曲線的建立 分別以10倍稀釋的重組質粒為標準品模板，加入探針，按照優化的體系進行RRT-PCR反應，在實時熒光定量PCR儀中檢測熒光信號，分別對引物和探針濃度、循環參數、樣本用量等進行優化。并利用隨機軟件進行分析，建立標準曲線。將標準質粒10倍稀釋成含有104～108拷貝/μL的5個梯度，按照優化的反應體系進行RRT-PCR，并使用7500 system SDS software進行分析，獲得標準曲線。

1.2.5 RRT-PCR的敏感性、特異性和重復性 將EID50為10-9.0的H9N2毒株雞胚尿囊液10倍系列稀釋，對陽性質粒模板進行10倍系列稀釋，用常規 PCR（使用國標引物 GB-up與 GB-low）和RRT-PCR檢測，比較其敏感性；以NDV、ILTV、IBV病毒核酸和健康雞組織RNA、水為模板，進行熒光定量PCR，以判斷該法的特異性；進行批、批間重復性試驗評估RRT-PCR的重復性，批內重復性試驗：分別取等量的 3份不同滴度 (104、106、108拷貝/μL)的重組質粒進行熒光定量PCR檢測，每份樣品作3個重復；批間重復性試驗：取以上3份樣品，在同一反應條件下進行3次獨立的熒光定量PCR檢測。

圖1 RRT-PCR擴增曲線

2 結果與分析

2.1 反應體系的優化 采用矩陣法對引物濃度、探針濃度進行最佳配比篩選。結果表明，25μL反應體系中 10nmol/mL的引物各 0.25mL，10nmol/mL探針0.15mL，對標準品的檢測獲得最低的Ct值與最高熒光強度增加值(△Rn)。經各反應條件優選后，每次檢測的4個陰性對照均無Ct值，即無擴增曲線；陽性對照出現典型的擴增曲線；在熒光臨界值附近，3個重復樣品的擴增曲線基本重合。

2.2 RRT-PCR標準曲線的建立 按上述優化的反應條件，以10倍稀釋的重組質粒，取5.3×104～5.3×108拷貝/μL濃度的作為標準品模板，分別加入到RRT-PCR反應體系中進行擴增，系統自動分析軟件顯示Ct值與標準品濃度的對數之間存在良好的線性關系(圖1、2)。生成的標準曲線y軸為循環閾值，x軸為質粒標準品的拷貝數，斜率為-3.582，軸截距為48.298，直線方程為y=-3.582 lgx+48.298，相關系數 R2≥0.999。

2.3 RRT-PCR敏感性試驗 將EID50為10-9.0的LYQ雞胚尿囊液稀釋到10-7倍時，常規PCR檢測為陰性 (只能測出到10-5，檢測引物為國標引物)，而RRT-PCR仍能10-7測出。同時當標準質粒的濃度稀釋到5拷貝/μL時仍能出現典型擴增曲線。

圖2 RRT-PCR標準曲線

表1 重復性和穩定性試驗

從圖2可見，在較廣的范圍內 (5.3×104～5.3×108拷貝/μL)Ct值與質?？截悢档膶抵g呈現很好的線性關系，相關系數R2≥0.999。將其檢測限的Ct值通過標準曲線換算成拷貝數約為5拷貝/L，相當于5個病毒顆粒。從RRT-PCR和常規RT-PCR獲得陽性結果的最高稀釋度可看出，RRT-PCR的敏感性遠高于常規PCR。

2.4 特異性試驗 在同一反應條件下AIV陽性樣品出現擴增曲線，而NDV、I BV、ILTV、健康雞組織和水均無Ct值，無擴增曲線。

2.5 穩定性和重復性試驗 批內變異系數CV為0.16%～0.65%，批間變異系數為0.50%～0.65%，重復性與穩定性較好，誤差小，擴增效率穩定(表1)。由此說明，本試驗建立的RRT-PCR檢測方法重復性和穩定性較好。

2.6 結果判定 根據臨床樣品RRT-PCR擴增的Ct值來看，陽性樣品的平均Ct值均小于或等于40.00，陰性對照樣品在經43次循環后仍無Ct值，說明試驗的特異性強。因此，本試驗中Ct值小于40.00可認為是陽性，43次循環后仍無Ct值判為陰性，Ct值介于40與43間判定為可疑，需要重復檢測。

3 討論

目前檢測AIV比較常用的方法有病毒分離鑒定、電鏡、免疫組化、斑點雜交、常規PCR和ELISA等，這些檢測方法具有各自突出的優點，但都很難檢測微量AIV與準確定量。本試驗建立了一種快速且靈敏度高、特異性強及簡便的RRT-PCR方法，能夠對臨床上發生的H9N2亞型病毒進行檢測與準確定量[2-3]。所有步驟可在4h內完成，不需要常規PCR的后處理或電泳檢測，既簡化了操作步驟，快速簡便，易于大規模檢測，同時克服了常規PCR易產生假陽性、不能定量及操作復雜等問題。在AIV臨床樣品篩檢、流行病學監測及進一步深入研究了解AIV感染的分子機理和免疫調節機理等方面顯示良好的應用前景。

[1]甘孟侯主編.禽流感.第二版.北京:中國農業出版社,2002.

[2]Bernd Hoffmann,Martin Beer,Scott M.Reid,Peter Mertens,A review of rRT-PCR technologies used in veterinary virology and disease control:Sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organisation for Animal Health Veterinary Microbiology139,2009:1-23.

[3]Spackman,E.,Senne,D.A.,Bulaga,L.L.,Trock,S.,Suarez,D.L.,2003.Development of multiplex real-time RT-PCR as a diagnostic tool for avian influenza.Avian Dis.47,1087-1090.