MMP3在早期骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨下骨的表達及其意義*

張榮凱，方 航，盧華定，陳郁鮮，宋炎成，曾 春，趙 慶，蔡道章△

(1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院骨科1區(qū)，廣東 珠海 519000;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，廣東 廣州 510630)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退變性關(guān)節(jié)疾病，主要是關(guān)節(jié)軟骨的退變降解，表現(xiàn)為進行性軟骨變薄、纖維化、糜爛、裂隙、肉眼下潰瘍及全層關(guān)節(jié)面消失等，并涉及關(guān)節(jié)的其它組織，包括關(guān)節(jié)的滑膜、軟骨下骨及肌肉、韌帶等結(jié)構(gòu)的改變［1］。以往對OA的病因研究多集中于關(guān)節(jié)軟骨的破壞，目前越來越多的研究表明，軟骨下骨改變在OA發(fā)病過程中起著積極作用，軟骨下骨改變有可能先于關(guān)節(jié)軟骨的變化［2－3］。最近研究表明，破骨細胞在早期骨關(guān)節(jié)炎疾病進程中起了重要作用，在骨關(guān)節(jié)炎早期，軟骨下骨的破骨細胞活動增強，從而導(dǎo)致骨吸收作用明顯強于成骨作用，進而引起軟骨下骨的骨量丟失，骨質(zhì)量下降。在軟骨下骨的骨吸收作用中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)起了重要的作用，可降解關(guān)節(jié)中的骨基質(zhì)，特別是破骨細胞表達的基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)可能在軟骨下骨的骨吸引中起重要作用［4－5］。然而，有關(guān)早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨MMP3表達的研究在國內(nèi)外報道極少。本研究利用大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，首次從基因及蛋白水平全面研究早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨的MMP3表達情況，為闡述其在骨關(guān)節(jié)炎致病機制中的重要作用提供依據(jù)，有利于OA的早期診斷和治療。

材料和方法

1 動物選擇與分組

選取大小、體重相似(10周齡，體重300～325 g)的雄性SD大鼠60只，由中山大學(xué)動物實驗中心提供，并飼養(yǎng)于該實驗中心SPF級屏蔽環(huán)境中，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。動物房溫度(23±3)℃，相對濕度(60±5)%，每天照明12 h。大鼠編號后，隨機分為對照組(n=30)和實驗組(n=30)。

2 主要的試劑及儀器

MMP3多克隆抗體(Abcam);山羊抗鼠IgGⅡ抗(DAKO)，DAB顯色液(康為世紀)，蛋白酶 K(Sigma)，EDTA(Sigma)，蘇木素(Sigma)，E.Z.N.A.? Tissue RNA Kit(Omega Bio－Tek)，All－in－OneTMqPCR Mix(GeneCopoeia)，Allin－OneTMqPCR Primer(GeneCopoeia)，SX手術(shù)顯微鏡(安信化學(xué)儀器制造有限公司)，電動磨鉆(Strong 90，New Power)，石蠟切片機(Leica)，光學(xué)顯微鏡(Leica DMI 3000 B)，iQ5 Real－Time PCR Detection System(Bio－Rad)，分光光度計(ND －1000，Thermo Scientific)等。

3 大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的建立

實驗組大鼠用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后，選取右膝關(guān)節(jié)，去毛后，常規(guī)消毒鋪巾，依次切開皮膚、膝關(guān)節(jié)囊，行“內(nèi)側(cè)副韌帶切斷+內(nèi)側(cè)半月板切除”，用5－0可吸收線獨立縫合關(guān)節(jié)囊，以5－0絲線間斷縫合傷口。術(shù)后肌注1次青霉素40000 U抗感染，待麻醉蘇醒后腹腔注射曲馬多(10 mg/kg)止痛。同樣的方法處理對照組大鼠，但不切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，也不切除內(nèi)側(cè)半月板。

4 標(biāo)本獲取及處理

4.1 標(biāo)本的初步處理 于術(shù)后1、2、4周分別隨機抓取大鼠，對照組、實驗組各10只。于每一時點，對照組、實驗組各5只解剖分離右膝關(guān)節(jié)，在解剖顯微鏡下對膝關(guān)節(jié)面進行觀察，大體觀察后立即將骨組織置10%多聚甲醛4℃固定保存。另5只分離出膝關(guān)節(jié)后將股骨髁從骺板處折斷后立即將股骨髁放入液氮保存，用于進一步分離軟骨下骨組織及提取骨RNA。

4.2 標(biāo)本的進一步處理 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置10%多聚甲醛4℃固定48 h后，放入20%EDTA液于4℃冰箱內(nèi)脫鈣4周，每3 d換脫鈣液1次。常規(guī)脫水、浸蠟后包埋，沿膝關(guān)節(jié)矢狀面切片，每隔300 μm切片1次，每張切片厚度5 μm，行蘇木精－伊紅(HE)及番紅O－固綠(Safranin O－fast green)染色進行組織學(xué)觀察。

4.3 軟骨下骨的分離及其RNA的提取 將保存于液氮下的股骨髁拿出，放入液氮容器內(nèi)并固定，使用微動力磨鉆于液氮保護下打磨清除關(guān)節(jié)軟骨及骺板組織，操作中使用手術(shù)顯微鏡確保完全清除其它組織。將分離得到的軟骨下骨放入液氮研磨器中，將骨塊研磨成粉末后，使用E.Z.N.A.? Tissue RNA Kit，按試劑盒操作說明提取軟骨下骨RNA，用分光光度計法及瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA的質(zhì)量。

5 實時熒光定量PCR

采用染料法(SYBR Green I)進行相對定量分析，按照ΔΔCt解析法來進行實驗設(shè)計，以GAPDH作為內(nèi)參照基因。MMP3上游引物 5'－CGGTGGCTTCAGTACCTTTC －3'，下游引物5'－ACCTCCTCCCAGACCTTCA－3'。標(biāo)本 RNA反轉(zhuǎn)錄、qPCR反應(yīng)體系建立實驗步驟按試劑盒說明操作。PCR反應(yīng)條件，采用了標(biāo)準的三步法程序進行反應(yīng):95℃預(yù)變10 min 1個循環(huán);95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)。

6 免疫組化檢測

每塊骨組織連續(xù)切取5張切片(每張厚度5 μm，相距300 μm)行免疫組化染色:采用SABC(鏈霉親和素生物素酶復(fù)合物)法，陰性對照以PBS代替Ⅰ抗，以人乳腺癌組織切片為陽性對照。切片常規(guī)脫蠟，水化，用3%H2O2避光封閉15 min，檸檬酸高溫高壓8 min和蛋白酶K修復(fù)抗原后，加MMP3Ⅰ抗4℃下孵育過夜，將帶辣根過氧化酶Ⅱ抗37℃下孵育20 min，DAB溶液光鏡下控制顯色，漂洗后蘇木素復(fù)染、脫水、透明，中性樹脂封片，切片置于40倍顯微鏡下觀察切片。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差()，均數(shù)比較采用t檢驗，α=0.05。

結(jié) 果

1 SD大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的成功建立

1.1 術(shù)后膝關(guān)節(jié)大體標(biāo)本觀察結(jié)果 術(shù)后1周，實驗組與對照組與股骨髁軟骨面光滑如常，關(guān)節(jié)面無破損;術(shù)后2周，實驗組股骨內(nèi)側(cè)髁與脛骨內(nèi)側(cè)平臺軟骨表面稍顯粗糙，極少關(guān)節(jié)面見輕微糜爛，外側(cè)股骨髁光滑如常;術(shù)后4周，實驗組雙側(cè)股骨髁均見明顯的軟骨面輕度糜爛，部分關(guān)節(jié)潰瘍磨損，而且內(nèi)側(cè)股骨髁比外側(cè)更嚴重，無骨贅形成。

1.2 術(shù)后膝關(guān)節(jié)病理切片觀察結(jié)果 術(shù)后1周，實驗組與對照組軟骨表面光滑平整，細胞數(shù)目和軟骨細胞排列無明顯差異，番紅O－固綠染色不均勻，特別是表層染色減退，但潮線尚完整，見圖1A、B、G、H;術(shù)后2周，軟骨表面見較多裂隙，有的甚至伸入輻射層，軟骨細胞數(shù)量明顯增多，結(jié)構(gòu)開始有點紊亂，可見軟骨細胞簇集，表層細胞變圓及其片狀剝脫現(xiàn)象，軟骨破壞較重的關(guān)節(jié)面可見表層軟骨變薄，部分關(guān)節(jié)面纖維組織覆蓋，見圖1C、D、I、J;術(shù)后4周，看見局部表面，軟骨細胞脫落消失，直到鈣化層和軟骨下骨交界處，此處表層覆蓋大量的纖維素，細胞數(shù)目整體明顯增多，細胞簇集現(xiàn)象明顯，見圖1E、F、K、L。

Figure 1.Histological analysis of cartilage degradation at each time point post－surgery(×20).A，C，E，G，I，K:sections stained with HE;B，D，F(xiàn)，H，J，L:sections stained with safranin O － fast green.Scale bar=100 μm.圖1 實驗組與對照組標(biāo)本切片蘇木精－伊紅(HE)及番紅O－固綠染色

以上觀察結(jié)果表明:以“內(nèi)側(cè)副韌帶切斷+內(nèi)側(cè)半月板切除”造成的膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)隨著術(shù)后時間進展，關(guān)節(jié)面的損傷慢慢加重，本實驗成功建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型［6］。

2 軟骨下骨RNA提取結(jié)果

實驗組與對照組股骨髁標(biāo)本，用液氮下微動力磨鉆打磨的方法分離得到的軟骨下骨，進一步提取的骨RNA濃度為(357.71±157.74)mg/L，A260/A280值為2.030±0.014;瓊脂糖凝膠電泳法對每個標(biāo)本RNA分析顯示:RNA電泳條帶清晰，28S∶18S約為2∶1，表明RNA完整無降解。以上結(jié)果表明:本方法在分離軟骨下骨時能有效避免骨RNA的降解，確保得到高質(zhì)量的骨RNA用于后繼的qPCR實驗。

3 軟骨下骨MMP3 mRNA的表達量分析結(jié)果

實時熒光定量PCR結(jié)果示:實驗組與假手術(shù)組相比較，在術(shù)后1周，軟骨下骨的MMP3在實驗組的表達量明顯升高，是對照組的8.34倍(P＜0.05);術(shù)后2周，MMP3在實驗組的表達量也升高，是對照組的4.85倍(P＜0.05)，但相對于術(shù)后1周，表達量有所下降;術(shù)后4周，2組的MMP3表達量無差異表達，見圖2。以上結(jié)果表明，軟骨下骨中的MMP3在極早期骨關(guān)節(jié)炎的表達量明顯增加，提示了MMP3在極早期骨關(guān)節(jié)炎的軟骨下骨中可能起了重要的作用。

4 軟骨下骨的MMP3免疫組化結(jié)果

如圖3所示，術(shù)后1、2周，實驗組軟骨下骨區(qū)檢測到大量的MMP3陽性細胞，以小單核細胞及多核巨細胞為主，其中多核巨細胞胞漿MMP3陽性較明顯;特別在靠近骨小梁區(qū)，破骨細胞樣MMP3陽性多核巨細胞明顯增多。而且，術(shù)后1周陽性細胞比例明顯高于術(shù)后2周，陽性的強度也較高。術(shù)后4周實驗組、對照組及陰性對照組織切片均未檢測到MMP3陽性細胞。免疫組化檢測結(jié)果從蛋白水平驗證了早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨MMP3的表達，而且與熒光定量PCR的結(jié)果相一致。

Figure 2.MMP3 mRNA expression detected by real－time PCR at each time point.*P ＜0.05 vs control group.圖2 實驗組與假手術(shù)組軟骨下骨MMP3 mRNA的表達

討 論

軟骨下骨改變在OA發(fā)病過程中起著積極作用，特別是與關(guān)節(jié)軟骨緊靠的軟骨下骨，其與軟骨的相互作用可能也越密切。研究早期OA的軟骨下骨改變對于OA的早期診斷、早期治療有著重大意義［7］。軟骨下骨包括軟骨下骨板以及緊靠其下方的骨小梁、血管和小梁間的腔隙，在OA病例中，常可以觀察到軟骨下骨硬化、囊性化、無菌性壞死等改變［8］。有研究表明軟骨下骨中產(chǎn)生的炎癥因子，可改變軟骨細胞的代謝，進而引起關(guān)節(jié)軟骨破壞及進行性惡化［9－10］。

Figure 3.Immunohistochemical staining of MMP3 in subchondral bones(A，C，E，G，I，K)and polynuclear giant cells(B，D，F(xiàn)，H，J，L)in experimental group and control group at each time point post－surgery(×40).圖3 軟骨下骨MMP3免疫組化圖

然而，目前缺乏早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨活體組織的相關(guān)研究報道，其原因主要是:(1)獲取合適的早期OA的人軟骨下骨標(biāo)本十分困難，而研究晚期OA的軟骨下骨標(biāo)本因硬化、囊性變等晚期改變導(dǎo)致難以推斷其早期的分子機制;(2)利用細胞培養(yǎng)技術(shù)研究的破骨細胞及成骨細胞的功能容易受培養(yǎng)環(huán)境影響，并不能真正地反映活體組織軟骨下骨細胞功能改變;(3)獲取能用于后繼研究的高質(zhì)量軟骨下骨RNA難度較大。因此，本實驗設(shè)計使用的SD大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，結(jié)合首創(chuàng)的液氮下微動力磨鉆打磨分離膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的方法，有效避免了軟骨下骨RNA的降解，很好地解決以上矛盾，是軟骨下骨基因表達相關(guān)研究值得推廣的方法。

本骨關(guān)節(jié)炎動物模型與其它動物模型相比，具有體積小、價廉、易飼養(yǎng)、解剖及生理學(xué)特點與人類相似的特點。有研究表明，使用前交叉韌帶+內(nèi)側(cè)半月板切除建立的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型在術(shù)后4周與人類的早期膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，特別是創(chuàng)傷后(如半月板損傷、交叉韌帶損傷等)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，在病理、病生以及形態(tài)學(xué)改變等方面極為相似［6，11］，更重要的是大鼠的基因組已明確，可以利用該動物模型從基因水平研究軟骨下骨在骨關(guān)節(jié)炎疾病進程不同時點的分子機制。

MMP3屬于基質(zhì)溶解酶，廣泛參與包括蛋白聚糖、纖維結(jié)合蛋白、層黏連蛋白、凝膠、Ⅳ型膠原和Ⅸ型膠原等各種細胞外基質(zhì)的降解過程，是破骨細胞骨吸收作用的重要因素之一。Hayami等［6］研究指出本動物模型在術(shù)后2周軟骨下骨骨量明顯減少，本研究中，關(guān)節(jié)不穩(wěn)定因素導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變是唯一的實驗因素，這一因素啟動了軟骨下骨表達MMP3，MMP3參與骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致骨量減少并在術(shù)后2周引起了形態(tài)學(xué)改變，這個實驗結(jié)果與其他學(xué)者研究的結(jié)果相似［5］。有趣的是，Shibakawa等［4］利用人類晚期膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)本，用免疫組化技術(shù)在緊靠鈣化軟骨層的軟骨下骨部位也檢測到MMP3的高表達，并指出MMP3的表達進一步引起了關(guān)節(jié)軟骨的退變，提示了本實驗結(jié)果與人類骨關(guān)節(jié)炎疾病極為相似。但是，本實驗只研究了早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨MMP3的表達，缺乏在更早期及更晚期的軟骨下骨MMP3表達信息;此外，MMP3的基因及蛋白表達是如何調(diào)控的，目前尚不清楚，這些都值得進一步深入研究。

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