神經生長因子對肝星狀細胞膠原分泌及形態學的影響*

舒建昌, 朱海燕, 呂 霞, 何雅軍, 陳蓮香, 葉國榮

(暨南大學附屬廣州紅十字會醫院 消化內科，廣東 廣州 510220)

神經生長因子對肝星狀細胞膠原分泌及形態學的影響*

舒建昌△, 朱海燕, 呂 霞, 何雅軍, 陳蓮香, 葉國榮

(暨南大學附屬廣州紅十字會醫院 消化內科，廣東 廣州 510220)

目的： 觀察神經生長因子(NGF)對大鼠肝星狀細胞(HSCs)膠原分泌功能和形態學的影響，探討NGF抗肝纖維化的作用機制。方法大鼠肝星狀細胞株(HSCs-T6)經不同濃度NGF作用24 h后，ELISA法檢測上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量；通過倒置顯微鏡、吖啶橙染色及透射電鏡觀察形態學變化。結果NGF作用HSCs 24 h后培養上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量與對照組相比明顯減少(Plt;0.05)，但無劑量依賴性。倒置顯微鏡下可見細胞數目變少，細胞變小，形態向橢圓形或圓形改變；吖啶橙染色及透射電鏡可以見到細胞凋亡的形態學變化。結論NGF可抑制HSCs合成Ⅰ、Ⅲ型膠原,誘導HSCs凋亡,抑制HSCs膠原分泌，可能是NGF抗肝纖維化的作用機制。

肝星狀細胞； 膠原； 形態學； 神經生長因子

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)又名Ito細胞、竇周細胞等，其激活是肝纖維化發生的中心環節。活化的HSCs大量合成和分泌膠原等細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，由于細胞外基質的合成與降解失平衡，合成增多，降解減少，使大量細胞外基質沉積，最終引起肝纖維化、肝硬化。近年來神經生長因子(nerve growth factor，NGF)在肝纖維化中的作用越來越受到關注[1-3]。本研究觀察了NGF對HSCs膠原分泌及形態學的影響，以幫助探討NGF抗肝纖維化作用的機制。

材 料 和 方 法

1材料

NGF購自Ramp;D；吖啶橙購自Sigma；DMEM培養液、胎牛血清購自Gibco；ELx800酶標儀購自BioTek；LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡購自Zeiss。HSCs - T6 由上海中醫藥大學徐列明教授提供,系SV40 轉染的大鼠肝星狀細胞,具有活化HSCs 的表型。

2方法

2.1NGF貯存液 NGF粉末用含0.1% BSA的無菌PBS溶解，配制成100 mg/L的貯存液，-20 ℃保存，1個月內有效。使用時用含10%血清的DMEM培養液稀釋至所需濃度。

2.2細胞的培養與傳代 采用含1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素、10 %胎牛血清的DMEM 培養液,在37 ℃、5 %CO2及飽和濕度下培養,隔天換液,待細胞長至80 %～90 %密度時,用0.02 %EDTA 和0.25 %胰蛋白酶消化, 按1∶4傳代。

2.3Ⅰ、Ⅲ型膠原的檢測 采用雙抗夾心ELISA方法檢測，取對數生長期細胞，以5×108/L細胞密度接種于T-25培養瓶中，24 h后各加入不同濃度(0、100、200、400 μg/L)的NGF培養24 h后，收集培養上清液，分別取已包被抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原單抗的96孔酶標板，每孔按照上清液編號分別加入100 μL上清液和100 μL標準品，37 ℃孵育60 min；每孔內加入350 μL洗滌液洗滌反應板，反復洗滌5次；每孔分別加入新鮮稀釋的生物素化抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原，37 ℃孵育60 min；同上洗滌5次；每孔加入HRP稀釋液，37 ℃孵育30 min；同上洗滌5次；再加入TMD顯色液，37 ℃暗處孵育20 min；每孔加入終止液，輕輕混勻30 s，30 min內在450 nm處讀取A值；以A值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據培養液上清樣品的A值在標準曲線上查出其濃度。

2.4吖啶橙染色 提前消毒6孔板及以多聚賴氨酸處理的蓋玻片(面積約4 cm2)，在6孔板每孔放置蓋玻片1張。取對數生長期細胞，以7×107/L細胞密度滴加于提前處理好的置于6孔板內的蓋玻片上，每孔滴加0.4 mL細胞懸液，培養箱中孵育24 h，以100 μg/L NGF為實驗濃度作用于培養細胞，再培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化并拍照，每孔加入PBS洗滌玻片10 min×3次，加入4%多聚甲醛2 mL固定30 min，棄去固定液，每孔再加入蒸餾水洗滌玻片。精確稱取吖啶橙10 mg，溶于100 mL三蒸水中，配制成100 g/L的吖啶橙染液，取染液2 mL將每張蓋玻片浸泡染色7 min， 再于0.01 mol/L PBS中洗滌5 min×3次，直接在載玻片上封片，即在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.5透射電鏡觀察 取對數生長期細胞，將5×108/L細胞接種于T-25培養瓶中，取100 μg/L NGF作為實驗濃度，與HSCs共同孵育24 h后，收集懸浮與貼壁細胞，1 000 r/min離心5 min，0.01 mol/L PBS重懸細胞，2.5%戊二醛固定15 min，1%四氧化鋨固定30 min，常規電鏡樣品制備程序脫水、包埋、超薄切片和鈾鉛染色，透射電鏡觀察并照相。

3統計學處理

結 果

1HSCs分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原的檢測結果

各濃度NGF對HSCs合成Ⅰ、Ⅲ型膠原均有抑制作用(Plt;0.05)，但各濃度間無顯著差異(Pgt;0.05)，見表1。

表1 不同濃度NGF對HSCs合成Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

2倒置顯微鏡觀察結果

倒置顯微鏡下，可見對照組HSCs呈梭形、星形或形態不規則，胞體近中央處有橢圓形的胞核，呈成纖維細胞樣表型。而100 μg/L NGF與HSCs作用24 h后，倒置顯微鏡下可見細胞增殖減慢，細胞數量變少，細胞體積變小，部分細胞脫落，見圖1。

Figure 1. Effect of 100 μg/L NGF on the morphological changes of HSCs observed by inverted microscopy (×200).A:control;B:NGF 100 μg/L.

3吖啶橙染色結果

對照組細胞多呈梭形、星形，胞體舒展，形態較一致；胞核規整，為圓形或類圓形，為均勻一致的綠色熒光；胞漿發桔紅色熒光。100 μg/L NGF作用HSCs后細胞數量減少，且細胞體積縮小、形態不規整，細胞核固縮，熒光增強，可見濃縮致密的暗綠色或黃綠色熒光，見圖2。

Figure 2. Effect of 100 μg/L NGF on the morphological changes of HSCs observed by acridine orange staining (×200).A:control;B:NGF 100 μg/L.

4透射電鏡觀察結果

100 μg/L NGF作用HSCs后，凋亡細胞體積較正常細胞明顯縮小，核染色質濃縮，沿核膜排列，細胞器也發生濃縮，并可以見到凋亡小體形成，見圖3。

Figure 3. Effect of 100 μg/L NGF on the morphological changes of apoptosis of HSCs observed by TEM.A: normal HSCs(×6 200); B: chromatin condensation and margination inside the nuclear membrane(×8 900); C: nuclear chromatin condensation and shrinkage(×15 000); D: reduced nuclear volume, cleavage into multiple dense bodies, and apoptotic body formation with complete membrane framework (×8 900).B,C,D:100 μg/L NGF group.

討 論

肝纖維化是所有慢性肝病共有的病理改變。HSCs激活是肝纖維化的中心環節，正常的HSCs處于靜止狀態，激活后發生表型轉換成為肌成纖維樣細胞，細胞大量增殖，進而分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白等多種ECM成分，造成以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主要成分的ECM 合成增多、降解相對不足，甚至降解被抑制，最終可造成ECM在肝內過量沉積，導致肝纖維化的發生發展[4]。

NGF除了具有神經營養因子的一般功能外，還可以誘導細胞凋亡，多是通過低親和力受體——p75神經營養因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)來介導。當僅有p75NTR單獨存在，而無高親和力受體(TrkA)表達時，NGF與p75NTR結合可引起細胞凋亡[5]。核轉錄因子-κB ( nuclear factor-κB,NF-κB)普遍存在于多種細胞中,在受到氧自由基、內毒素等刺激時NF - κB 可被激活,啟動一些相應的基因,導致機體一系列的改變[6]，研究發現：肝臟受損時肝細胞可表達NGF；用重組體NGF培養HSCs，細胞凋亡明顯增多，且具有劑量依賴性，NGF能降低P50/P65 NF - κB異源二聚體活性，其中NF-κB的降低伴隨著caspase-3活性的顯著增高[7]。給予外源性NGF(0.1～100 μg/L)干預HSCs后，以吖啶橙染色觀察細胞凋亡數目，發現NGF濃度為100 μg/L時，HSCs表現明顯的凋亡[2]。本小組前期研究也發現HSCs在100 μg/L的NGF作用下，細胞增殖被抑制并出現凋亡(結果另文發表)。

目前尚未見有關NGF作用HSCs后對Ⅰ、Ⅲ型膠原表達影響的研究報道，本研究采用ELISA方法檢測經過NGF作用前、后HSCs培養基上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化，發現與對照組比較，各濃度NGF作用HSCs后上清液Ⅰ、Ⅲ型膠原表達減少，這可能與NGF抑制HSCs增殖、誘導其凋亡，從而影響Ⅰ、Ⅲ型膠原的基因表達、抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的分泌等有關，具體分子生物學機制以及對其它ECM的分泌有無影響還有待進一步研究。

吖啶橙熒光染色是觀察細胞凋亡形態學變化的一種簡便可靠的方法[8]，吖啶橙能夠透過細胞膜，把細胞核內的DNA染成綠色，細胞漿內的RNA染成桔紅色，凋亡細胞的細胞核固縮或碎裂，因此呈現致密濃染的黃綠色，有時可見碎塊狀[9]。本實驗結果顯示：NGF作用HSCs后倒置顯微鏡和吖啶橙染色顯示細胞數量減少，細胞體積縮小、形態不規整，細胞核固縮，吖啶橙染色顯示實驗組熒光增強，可見濃縮致密的暗綠色或黃綠色熒光；透射電鏡可見凋亡細胞體積較正常細胞明顯縮小，核染色質濃縮，沿核膜排列，細胞器也發生濃縮，并可以見到凋亡小體形成，出現了典型的細胞凋亡形態學變化，進一步說明經NGF作用后HSCs發生了細胞凋亡，NGF可能由此而發揮抗肝纖維化作用。

NGF的作用特點是針對不同靶細胞可能發揮完全相反的兩種作用，有關NGF對HSCs的增殖、凋亡及對肝纖維化的影響等方面的相關研究較少。本研究觀察到NGF可抑制HSCs分泌膠原，引起HSCs出現細胞凋亡的形態學改變，有助于明確NGF抗肝纖維化的相關作用機制。關于NGF在肝損傷、肝纖維化發病過程中對HSCs的具體作用機制、NGF抗肝纖維化的確切作用機理等如何，尚需進一步深入研究。

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EffectsofNGFoncollagensecretionandmorphologyofhepaticstalletecells

SHU Jian-chang, ZHU Hai-yan, Lü Xia, HE Ya-jun, CHEN Lian-xiang, YE Guo-rong

(DepartmentofGastroenterology,GuangzhouRedCrossHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,Guangzhou510220,China.E-mail:shujc62@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of nerve growth factor (NGF) on the changes of collagen secretion and morphology of hepatic stallete cells(HSCs).METHODSRat HSCs were incubated with different concentrations of NGF for 24 h. Collagen I and III in the supernatants of culture medium secreted by HSCs were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The morphological changes of HSCs were observed under inverted microscope with acridine orange staining and under transmission electronic microscope.RESULTSWhen HSCs was incubated with NGF at concentrations of 100, 200 or 400 μg/L for 24 h, the content of collagen I and collagen III in the culture supernatants were significantly reduced compared with control group (Plt;0.05). After stimulated with NGF at the concentration of 100 μg/L for 24 h, the growth of the HSCs was inhibited and the morphous of the cells became round or oval gradually. The morphological changes of apoptotic cells were also observed by acridine orange staining and transmission electronic microscopy.CONCLUSIONNGF inhibits HSCs to synthesize collagen I and collagen III. Inhibition of collagen production and promotion of apoptosis in HSCs may be the possible mechanisms of NGF to reverse liver fibrosis.

Hepatic stellate cells; Collagen; Morphology; Nerve growth factor

1000-4718(2011)12-2396-03

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.030

2011-07-08

2011-11-20

廣東省自然科學基金資助項目(No.9151051501000083);廣州市科技局計劃(No.2010Y1-C691)

△通訊作者 Tel：020-34403828；E-mail：shujc62@hotmail.com