Treg/Th17失衡在膿毒癥發病機制中的作用

吳鐵軍, 張麗娜, 亢翠翠

(聊城市人民醫院ICU，山東 聊城 252000)

Treg/Th17失衡在膿毒癥發病機制中的作用

吳鐵軍, 張麗娜△, 亢翠翠

(聊城市人民醫院ICU，山東 聊城 252000)

目的： 觀察膿毒癥患者外周血中CD4+CD2+CD127-調節性T細胞(Treg)及輔助性T細胞17(Th17)的比例，并探討Treg/Th17失衡在膿毒癥發病中的作用。方法選擇2010年1～8月入住我院ICU的膿毒癥患者70例，按疾病嚴重程度分為膿毒癥組(34例)、重癥膿毒癥組(21例)和膿毒癥休克組(15例)。第1 d抽取外周血，應用流式細胞術檢測不同組別患者外周血中Treg/Th17比例及CD14單核細胞 HLA-DR表達率，并探討Treg/Th17比例與免疫狀態及病情嚴重程度(APACHEⅡ評分)的關系。選取同期健康查體者為對照組(30例)。結果(1) 和對照組相比，各病例組外周血Treg及Th17比例均明顯升高(均Plt;0.01)，但升高的程度不同。Th17表達以重癥膿毒癥組升高最明顯，Treg表達以膿毒癥休克組升高最明顯。(2)Treg/Th17：膿毒癥休克組gt;重癥膿毒癥組gt;膿毒癥組，各組兩兩相比均有顯著差異(均Plt;0.01)。膿毒癥組Treg/Th17顯著低于對照組(Plt;0.01)，膿毒癥休克組Treg/Th17顯著高于對照組(Plt;0.01)，但重癥膿毒癥組Treg/Th17與對照組比較無明顯差異。(3)CD14單核細胞HLA-DR表達率：膿毒癥休克組lt;重癥膿毒癥組lt;膿毒癥組lt;對照組，兩兩比較均有顯著差異(均Plt;0.01)。(4)Th17比例和APACHEⅡ評分及 HLA-DR表達率無相關性;Treg表達率和APACHEⅡ評分正相關(r=0.93，Plt;0.01)，和HLA-DR表達率負相關(r=-0.89，Plt;0.01);HLA-DR表達率和APACHEⅡ評分負相關(r=-0.91，Plt;0.01)。結論(1)膿毒癥患者中Treg和Th17比例失調，Treg/Th17的失衡參與膿毒癥的發病及進展。(1)Treg表達率可以在一定程度上反映機體病情及免疫狀態。

膿毒癥； 休克，膿毒性； Th17細胞; T淋巴細胞，調節性

膿毒癥是重癥監護病房(intensive care unit， ICU)最常見的死亡原因之一，重癥膿毒癥死亡率可高達60%[1]。現在人們認識到，膿毒癥觸發炎癥反應的同時，機體發生抗炎反應，促炎/抗炎的動態演變決定著膿毒癥的發展趨勢。近年來Treg及Th17的發現更新了CD4 T細胞的內容。目前認為CD4 T細胞包括Th1、Th2、Treg、Th17四個細胞亞群。Treg/Th17是Th2/Th1的分支，分別起到抗炎和促炎作用。二者失衡導致多種自身免疫疾病及慢性炎癥的發生[2]。Th2/Th1的漂移決定膿毒癥的發展，然而Treg/Th17的失衡是否參與膿毒癥的發病及進展，相關研究較少。本研究通過檢測Treg/Th17及機體免疫狀態的變化，探討其在膿毒癥中發揮的作用。

材 料 和 方 法

1研究對象

選擇2010 年1～8 月入住我院ICU的膿毒癥患者70例，年齡(53.3±18.2) 歲。門診健康查體者30例作為對照組。各組間年齡構成無顯著差異。膿毒癥、重癥膿毒癥及膿毒癥休克的診斷標準為2001年美國胸科醫師學院(American College of Chest Physicians,ACCP)/ 美國危重病醫學會(Society of Critical Care Medicine SCCM)共識會議制定[3]。排除以下患者：患有自身免疫系統疾病(如類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡、哮喘等疾病)、急性腦卒中、心肌梗死、病毒性肝炎和人類免疫缺陷病毒(humsan immunodeficiency virus，HIV)感染，入院前3個月內使用過激素或免疫抑制劑。

2方法

2.1標本收集 符合診斷標準的患者于診斷成立后2 h內采靜脈血10 mL，肝素抗凝置于4 ℃冰箱，4 h內對標本進行培養與檢測。同時計算APACHEⅡ評分，即以入院24 h內最差生理指標為標準進行評分。計算急性生理學變量分值、年齡因素分值和慢性健康狀況分值的總和作為APACHEⅡ分值。分值愈高則提示病情愈嚴重。健康對照組30例同時進行實驗。

2.2流式細胞術檢測Th17 (1)取留取的肝素鈉抗凝外周靜脈血標本5 mL。(2)淋巴細胞刺激及高爾基體蛋白轉運抑制：取外周血50 μL，與50 μL RPMI-1640培養基混勻，加入5 μL刺激劑(BD)，37 ℃、5%CO2培養箱培養刺激4～6 h。(3)標記細胞膜表面CD3、CD4：取出刺激后的細胞，混勻，加入CD3 PC5 10 μL、CD4 FITC 20 μL(BD)，避光孵育20 min。(4)破膜：加入破膜固定劑中的1液200 μL，輕微混勻，避光固定15 min，加入2 mL PBS，混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL破膜固定劑中的2液，輕微混勻，靜置5 min。(5)標記胞內IL-17并標記內對照抗體：收集上述細胞等分為測定管和同型對照管，測定管加入IL-17A-PE 5 μL(EB)，對照管加入內對照抗體(IgG1-PE)5 μL，室溫避光孵育30 min，加入2 mL PBS混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清。(6)Th17亞群檢測：BD FACS Calibur 流式細胞儀上機檢測，以CD3設門，CD3+、CD4+、IL-17A+為Th17。

2.3流式細胞術檢測Treg 取留取的肝素鈉抗凝外周靜脈血標本2 mL。100 μL抗凝血分別加入細胞標記抗體CD4-ECD-CD25-PC5-CD127-PE及相應的同型對照單抗各10 μL?；靹颍瑴厥冶芄夥跤?5 min，加入1.5 mL紅細胞裂解液。混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入1.5 mL PBS混勻，1 500 r/min離心5 min。棄上清，重復1次，0.5 mL PBS重懸細胞。 2 h內三色流式細胞儀檢測。CD4+CD25+CD127-細胞即為Treg。

2.4流式細胞術檢測CD14+單核細胞 HLA- DR表達率 (1)取流式細胞檢測管2管 ,分別標記 CD14+HLA-DR管及陰性對照管 ,每管取 100 μL血加入 10 μL CD14-PC5,再分別加入 10 μL HLA- DR-FITC及同型對照 ,室溫避光染色 15 min。(2)染色后標本中加入溶血素 500 μL ,溶血15min。(3)加入 PBS 500 μL,4 ℃保存 ,24 h內上機檢測。(4)以 CD14-PC5設門 ,檢測 HLA-DR表達率。(5)所得數據經 EXP OS32 ACD軟件獲取和分析。

3統計學處理

結 果

1Treg/Th17的比例

和對照組相比，膿毒癥患者外周血Treg和Th17比例均明顯升高，但升高的程度不同。其中Th17表達以重癥膿毒癥患者升高最明顯，而Treg表達以膿毒癥休克患者升高最明顯，見表1。

2Treg/Th17的平衡狀態

各病例組Treg/Th17比值不同，膿毒癥休克組gt;重癥膿毒癥組gt;普通膿毒癥組。兩兩相比均有顯著差異，膿毒癥組Treg/Th17顯著低于對照組，膿毒癥休克組Treg/Th17顯著高于對照組，但重癥膿毒癥組Treg/Th17與對照組無明顯差別，見表1。

3膿毒癥患者免疫狀態的變化

CD14細胞 HLA-DR表達率在各組中亦有顯著差異，膿毒癥休克組lt;重癥膿毒癥組lt;膿毒癥組lt;對照組。兩兩比較均有顯著差異。以HLA-DR表達率lt;30% 為判斷患者存在免疫抑制的標準，膿毒癥休克患者中存在明顯的免疫抑制，見表1。

4Th17/Treg比例和APACHEⅡ評分及HLA-DR表達率的相關性

Th17比例和APACHEⅡ評分及 HLA-DR表達率無顯著相關，Treg比例和APACHEⅡ評分呈正相關(r=0.93，Plt;0.01)；和HLA-DR呈負相關(r=-0.89，Plt;0.01)。HLA-DR表達率和APACHEⅡ評分呈負相關(r=-0.91，Plt;0.01)。

表1 膿毒癥各組患者Th17/Treg的比例及HLA-DR的表達

討 論

膿毒癥發病逐年升高，為ICU最常見的死亡原因之一。膿毒癥并不是一種獨立疾病，而是包括免疫系統在內的多系統共同作用的結果。免疫機制在膿毒癥的發病中越來越受到重視。免疫細胞Treg、Th17分別起到抗炎和促炎作用。二者均由CD4T細胞分化而來，Treg表達Foxp3，通過接觸抑制及釋放抗炎因子IL-10及TGF-β，并通過多種途徑抑制淋巴細胞反應，發揮抗炎作用[4]。Th17表達RORγt，分泌IL-17及低水平的TNF-α及IL-6[5]，發揮促炎反應。Treg、Th17功能相反，但關系密切，相互依存，相互抑制，維持于一種平衡狀態。Treg/Th17正常值為1.5～2.4,可以反映炎癥反應狀態。升高提示抗炎反應占優勢，降低提示促炎反應占優勢。 二者平衡關系的破壞可導致多種疾病的發生[6]。已有多項研究表明Treg/Th17的失調和自身免疫疾病及慢性炎癥急性發作有密切關系。美國學者David發現Treg/Th17的失衡預示炎癥性疾病惡化[7]。我們的研究表明膿毒癥患者中Treg的表達水平明顯升高，并且和膿毒癥患者的細胞免疫呈負相關[8]。國外近期研究表明，Treg直接導致淋巴細胞增殖能力下降。2009年我們的研究發現Th17亦參與膿毒癥的發生[9]。既然Treg及Th17二者相互制約，關系密切，又同樣在膿毒癥中異常表達，那么在膿毒癥中它們之間的平衡狀態如何，是否影響膿毒癥的進展及免疫狀態，為此我們進行了此項研究，并得到部分答案。

我們的研究發現和對照組相比，膿毒癥患者外周血Treg及Th17比例均明顯升高，但升高的程度不同。其中Th17以重癥膿毒癥患者升高最明顯，而Treg以膿毒癥休克患者升高最明顯。說明膿毒癥發生后機體發生強烈的促炎反應，患者體內Th17表達增加，抗感染免疫反應及清除病原體的能力增強，這是機體的代償防御反應，到重癥膿毒癥階段Th17表達尤為增高，機體炎性反應達到最高水平，隨著疾病再一步進展，到膿毒癥休克階段Th17細胞較前下降，機體清除病原體及抗感染能力下降。在機體發生促炎反應的同時，會代償性出現抗炎反應，Th17升高的同時Treg亦代償性升高。有研究表明，Treg通過細胞接觸機制和釋放細胞因子作用于效應T細胞，發生免疫抑制，影響Th1/Th2/Th17的極化，決定著炎性反應的不同結局[10]。Treg的升高往往導致免疫麻痹。同樣我們的研究發現，Treg和APACHEⅡ評分呈正相關，和HLA-DR表達率呈負相關，隨著膿毒癥→重癥膿毒癥→膿毒癥休克病情的加重，Treg逐漸升高，HLA-DR表達逐漸下降，免疫功能逐漸下降，到膿毒癥休克階段Treg達最高水平，HLA-DR表達則達最低水平，機體出現免疫抑制。而國外研究證實膿毒癥患者發病后6 h即發現Th1、 Th2、Treg、Th17 明顯下降[11]?？紤]Treg/Th17比例的升高與其它CD4 T細胞的下降幅度更大有關，而并不是由該細胞的數量升高所致。

目前關于膿毒癥發展的病理生理及分子機制是當膿毒癥發生后，機體發生SIRS(全身炎癥綜合征)的同時，產生內源性代償性抗炎反應，即CARS(代償性抗炎反應綜合征)，SIRS/CARS保持平衡則內環境穩定，不引起器官損傷。當二者同樣強烈時則為具有損傷性混合性拮抗反應綜合癥(mixed antagonistic response syndrome,MARS)，二者失衡則導致MODS的發生。而我們關于Treg/Th17平衡狀態的研究對膿毒癥有了進一步的認識。研究發現膿毒癥各組Treg/Th17比值不同，膿毒癥休克組gt;重癥膿毒癥組gt;膿毒癥組。各組兩兩相比均有顯著差異。膿毒癥組Treg/Th17顯著低于對照組，膿毒癥休克組Treg/Th17顯著高于對照組，但重癥膿毒癥組Treg/Th17與對照組無明顯差別。說明當膿毒癥發生后機體首先以SIRS為主，促炎反應占優勢，Treg/Th17降低。隨著疾病進展，抗炎反應也增強，到重癥膿毒癥階段，雖然Treg/Th17和對照組無異，但其實是由于促炎和抗炎反應同樣強烈，是矛盾下的相對平衡，也就是MARS，這一時期患者一旦得不到有效治療，這種平衡便很快會被打破，發生MODS。到膿毒癥休克階段Treg/Th17嚴重失衡，免疫麻痹，甚至死亡。

經典治療的失敗使人們認識到免疫水平的調節可能成為膿毒癥治療的突破[12]。我們的研究發現免疫細胞Treg、Th17在膿毒癥的發病中可能起到重要作用。Treg/Th17失衡參與膿毒癥的發病過程，影響患者免疫狀態，進一步揭示了膿毒癥的發病機理，為其干預治療提供依據。

[1]Brun-Buisson C, Meshaka P, Pinton P, et al .EPISEPSIS:a reappraisal of the epidemiology and outcome of severe sepsis in French intensive care units[J]. Intensive Care Med,2004,30(6):580-588.

[2]Baecher-Allan C, Hafler DA. Human regulatory T cells and their role in autoimmune disease[J].Immunol Rev,2006,212:203-216.

[3]Levy MM, Fink MP, Marshall JC, et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference[J]. Crit Care Med,2003, 31(4):1250-1256.

[4]Bettelli E,Oukka M,Kuchroo VK, et al.TH-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity[J].Nat Immunol,2007,8(4):345-350.

[5]LeGrand A,Fermor ,Fink C，et al.Interleukin-1，tumor necrosis factor α，and interleukin-17 synergistically up-regulate nitric oxide and prostaglandin E2production in explants of human osteoarthritic knee menisci [J].Arthritis Rheum，2001,44(9):2078-2083.

[6]張 妍, 崔保霞,馬道新,等.Th17細胞聯合CD3+CD8-IL-21+T細胞升高與宮頸癌發生發展的關系[J].中國病理生理雜志,2011,27 (6): 1103-1108.

[7]Favre D, Lederer S,Kanwa B, et al. Critical loss of the balance between Th17 and T regulatory cell populations in pathogenic SIV infection [J].PloS Pathog,2009,5(2):e1000295.

[8]張麗娜,吳鐵軍,劉志軍.膿毒癥患者血CD4+CD25+調節性T細胞水平檢測的臨床意義[J].中國呼吸與危重監護雜志,2010,9(4):416-418.

[9]亢翠翠，吳鐵軍.膿毒癥患者外周血中Th17細胞的變化特點[J].中國急救醫學雜志,2011,31(9)：836-838.

[10]Venet F,Chung CS, Kherouf H,et al.Increased circulating regulatory T cells (CD4+CD25+CD127-)contribute to lymphocyte anergy in septic shock patients[J]. Intensive Care Med, 2009, 35(4): 678-686.

[11]Venet F,Davin F,Guignant C,et al.Early assessment of leukocyte alterations at diagnosis of septic shock[J]. Shock,2010,34(4):358-363.

[12]欒櫻譯，姚詠明.膿毒癥中免疫負調控途徑的研究進展[J].中國病理生理雜志,2011,27 (3): 616-619，624.

EffectofdisequilibriumofTreg/Th17inpathogenesisofsepsis

WU Tie-jun, ZHANG Li-na, KANG Cui-cui

(IntensiveCareUnit,LiaochengPeople’sHospital,Liaocheng252000,China.E-mail:zln_109@126.com)

AIM: To investigate the disequilibrium of regulatory T-lymphocytes(Treg) T helper 17 cells (Th17) in sepsis.METHODSSeventy sepsis patients hospitalized in our ICU during January 2010 to August 2010 were enrolled in the study and divided into sepsis group (n=34), severe sepsis group (n=21) and septic shock group (n=15) based on the severity. Serum samples were collected from all the patients on the first day. The percentages of Th17 and Treg and HLA-DR expression in CD14 monocytes were determined by flow cytometry. The relationship between ratio of Treg/Th17, and immune state, pathogenetic severity (score of APACHE II) was also investigated. Thirty matched healthy individuals in the hospital for heath examination in the same period of time served as controls.RESULTSThe percentages of Th17 and Treg were significantly higher in all disease groups than those in control group (allPlt;0.01). The highest percentage of Th17 was observed in severe sepsis group and the highest percentage of Treg was found in septic shock group. The levels of Treg/Th17 ranged as septic shock group gt; severe sepsis groupgt; sepsis group and there was significant difference between every 2 groups (allPlt;0.01). The level of Treg/Th17 was lower in sepsis group and higher in septic shock group than that in control group (Plt;0.01), and no significant difference between severe sepsis group and control group was observed. The HLA-DR expression levels in CD14 monocytes ranged as septic shock group lt; severe sepsis group lt; sepsis group lt; control group, and there was significant difference between every 2 groups (allPlt;0.01). The expression of HLA-DR and score of APACHE II showed no correlation with the percentage of Th17. The percentage of Treg showed positive correlation with the score of APACHE II (r=0.93,Plt;0.01) and negative correlation with the expression of HLA-DR (r=-0.89,Plt;0.01). The HLA-DR expression showed negative correlation with the score of APACHE II (r=-0.91,Plt;0.01).CONCLUSIONThe ratio of Treg to Th17 is abnormal in sepsis patients. The disequilibrium of Treg/Th17 influences the development, of sepsis. To some extent, the level of Treg reflects the pathogenetic conditions and immune state of sepsis patients.

Sepsis; Shock, septic; Th17 cells; T-lymphocytes,regulatory

1000-4718(2011)12-2411-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.034

2011-05-18

2011-10-14

△通訊作者 Tel:0635-8276324； E-mail :zln_109@126.com