消癌平片微生物限度檢查法驗證

陸娟，陳建玲

(湖北省襄陽市食品藥品檢驗所，441021)

消癌平片是一種抗癌、消炎、平喘藥，主要成分是烏骨藤，臨床多用于食道癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤。本品具有一定的抑菌作用，用常規方法對其進行微生物限度檢查時，結果不能真實反映樣品的污染情況。按《中華人民共和國藥典》2010年版規定，在進行微生物限度檢查時，應對所用方法進行驗證，以確認所采用的方法適合該產品，準確有效地檢出樣品中污染的微生物［1］。按照《中國藥品檢驗標準操作規范》［2］及參考有關文獻［3-6］，筆者采用培養基稀釋法進行驗證，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 立式滅菌器(山東新華醫療器械股份有限公司)，HTY-761型勻漿儀(杭州泰林生物技術設備有限公司)，202-2型電熱恒溫干燥箱(上海浦東躍欣科學儀器廠)，SPX-150生化培養箱(慧科電子有限公司)，生物安全柜(蘇凈安泰)。

1.2 菌種 大腸埃希菌［CMCC(B)44102］，金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］，白念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉［CMCC(F)98003］。

1.3 培養基及稀釋劑 營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基(BL)、膽鹽乳糖發酵培養基、乳糖發酵培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基，以上均由北京三藥科技開發公司提供。含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，0.9%滅菌氯化鈉溶液，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，新配。

1.4 供試品 消癌平片(湖北創力藥業有限公司，批號:20101101，20101201，20110101)。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液 取營養瓊脂斜面新鮮培養物，接種于營養肉湯培養基中，30～35℃培養18～24 h;用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.2 白念珠菌菌液 取新鮮培養物接種于改良馬丁培養基23～28℃培養24～48 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲菌液 取新鮮培養物，接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7d，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液8mL將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋制成每毫升含孢子50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液制備 取供試品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100mL，用勻漿儀以2 000 r·min-1的轉速旋轉30 s，制備成1∶10的供試液。

2.3 回收率測定

2.3.1 實驗組 常規法:取供試液和實驗菌液各1mL，分別注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻待凝固后按規定條件培養，每日觀察計算菌落數，每種實驗菌平行制備2個平皿，結果見表1。

培養基稀釋法:取供試液0.2mL和實驗菌液1mL分別注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻待凝固后按規定條件培養，每日觀察計算菌落數，每種實驗菌平行制備10個平皿，結果見表2。

2.3.2 菌液組 取上述實驗菌液按常規法測定每一種菌株所加的實驗菌數。

2.3.3 供試品對照組 常規法:取供試液1mL注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻待凝固后按規定條件培養，每日觀察計算菌落數，每種實驗菌平行制備2個平皿，結果見表1。培養基稀釋法:取供試液0.2mL注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻待凝固后按規定條件培養，每日觀察計算菌落數，每種實驗菌平行制備10個平皿，結果見表2。

2.3.4 稀釋劑對照組 用相應稀釋劑代替供試液加入實驗菌，使菌液最終濃度為50～100 cfu·mL－1按實驗組方法進行菌落計數。

2.3.5 結果判斷 回收率(%)=(實驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。

2.4 控制菌檢驗驗證

2.4.1 實驗組 取1∶10供試液10mL接種至100mL膽鹽乳糖培養基中，同時加入50～100 cfu·mL-1大腸埃希菌菌液1mL，35℃培養24 h，取培養物0.2mL，接種至含MUG培養基5mL的試管中，35℃培養，5，24 h在366 nm紫外光燈下觀察，管內培養物呈現藍白熒光，為MUG陽性;然后進行靛基質實驗，液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性。

2.4.2 陰性菌對照組 方法同實驗組，實驗菌為金黃色葡萄球菌菌液。結果管內培養物不呈現熒光，為MUG陰性;然后進行靛基質實驗，液面呈試劑本色，為靛基質陰性。

表1 常規法回收率測定結果

表2 培養基稀釋法回收率測定結果

2.4.3 供試品對照組 方法同實驗組，但不加實驗菌，結果同陰性菌對照組。

2.4.4 結果判斷 實驗組檢出實驗菌，陰性菌對照組未檢出實驗菌，結果符合要求，控制菌按常規法檢查即可。

3 討論

消癌平片的微生物限度檢查驗證實驗中，稀釋劑對照組各菌落計數回收率均＞70%;常規法菌落計數大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率＜70%;培養基稀釋法各菌落計數回收率均＞70%，按供試品制備方法和培養基稀釋法對消癌平片進行細菌檢查，真菌和酵母菌檢查、控制菌檢查采用常規法是固定可行的。

實驗制備計數用的菌液稀釋到合適的濃度后，菌落數在48 h后有較大變化，宜控制好實驗時間，實驗的同時進行活菌計數，才能保證實驗結果的準確性。

目前國家越來越重視微生物限度檢查，《中華人民共和國藥典》收載的品種也越來越多。《中華人民共和國藥典》從2005年版開始對微生物限度檢查要求進行方法學的驗證實驗。由于某些供試品具有抗菌或抑菌活性，其本身會影響檢驗結果的準確性。通過方法學驗證，避免了采用常規方法難以檢出菌落，而得出“陰性”或計數偏低的“合格”結論的情況。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄C 79－88.

［2］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:351－407.

［3］顏棟林，李萍，蘭茜.冠心丹參片微生物限度檢查法方法驗證［J］.醫藥導報，2010，29(8):1080－1081.

［4］張麗梅，李俊，邢建華.抗生丸微生物限度檢查法的驗證［J］.醫藥導報，2009，28(6):792－793.

［5］李俊，張麗梅.6種中成藥微生物限度檢查方法驗證［J］.醫藥導報，2010，29(9):1222－1223.

［6］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京:科學出版社，2000:65.