刺五加注射液的安全性考察

李秀梅，范能全，趙欣欣，楊柳，詹宇杰，張芳艷

(重慶市藥品檢驗(yàn)所，401121)

刺五加注射液收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第18冊，系刺五加科植物刺五加經(jīng)提取有效成分而成的供靜脈滴注的中藥注射劑，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤作用外，還可治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱等癥。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的生物安全性檢驗(yàn)項(xiàng)目有熱原、異常毒性和無菌。通常按其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)上述指標(biāo)均符合規(guī)定，然而在臨床使用中不時(shí)發(fā)現(xiàn)其存在以下不良反應(yīng):藥物熱、過敏性休克、全身癥狀、藥疹、呼吸道反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)等［1-2］。

引起中藥注射液發(fā)生不良反應(yīng)的原因通常是高分子物污染、抗原性、與輸液的配伍作用等［3-4］。為進(jìn)一步考察刺五加注射液的安全性，筆者對3個(gè)廠家生產(chǎn)的刺五加注射液進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)考察，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 刺五加注射液76批(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司59批，黑龍江省珍寶島制藥有限公司哈爾濱分公司2批，黑龍江多多藥業(yè)有限責(zé)任公司15批);刺五加標(biāo)準(zhǔn)抗原(中國藥品生物制品檢定所抗生素室，規(guī)格:4 mg·mL-1);特異性刺五加抗體(中國藥品生物制品檢定所抗生素室);牛血清白蛋白干粉(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司);羊抗兔辣根過氧化物酶抗體(中國藥品生物制品檢定所);凝膠緩沖液(三羥甲基氨基甲烷36.33 g，丙烯酰胺0.3 g，加適量水，調(diào)pH至8.45，定容至100mL);陽極緩沖液(三羥甲基氨基甲烷 12.1 g，加適量水溶解，用鹽酸液調(diào)pH=8.9，定容至500mL);陰極緩沖液(三羥甲基氨基甲烷 6.05 g，tricine8.96 g，丙烯酰胺 0.5 g，定容至500mL，pH8.0);0.1% 硝酸銀染色液;過硫酸銨、甘油、硝酸銀和 N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺(TEMED)(分析純，華美生物工程公司);MAKER(ABI公司生產(chǎn)，國內(nèi)分裝);96孔酶標(biāo)板(COSTAR 2592);500 μL超濾管(Sartorius Vivaspin)。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(安圖2010);電泳儀(BIO-RAD公司);臺式高速離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 用間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)考察過敏物質(zhì) 用間接酶聯(lián)免疫法，按照中國藥品生物制品檢定所抗生素室提供的試劑盒操作規(guī)程依法操作。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)(由中國藥品生物制品檢定所抗生素室提供):計(jì)算空白對照的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)待檢樣品吸光度值高于或等于空白對照均值+5倍標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)，判定為陽性［5-6］。

1.3.2 超濾電泳實(shí)驗(yàn)考察大分子物質(zhì) 對制品中可能存在的大分子物質(zhì)進(jìn)行檢測。采用截留相對分子質(zhì)量10 000的超濾膜對刺五加注射液進(jìn)行超濾，并分別對原液、截留液、濾出液進(jìn)行Tris-Tricine SDS-PAGE電泳分析，考察各廠家的超濾、過濾工藝對刺五加注射液大分子物質(zhì)的截留效果，以評價(jià)不同廠家過濾工藝的優(yōu)劣［5，7］。膠液配方見表 1。

取刺五加樣品原液500 μL置于超濾管中，按轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1超濾 2.5 ～4.0min，收集超截留液和濾出液。并分別將樣品原液、截留液和濾出液進(jìn)行Tris-Tricine SDS-PAGE電泳。電泳畢，進(jìn)行銀染。

1.3.3 其他實(shí)驗(yàn) 按照現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了熱原、異常毒性以及無菌實(shí)驗(yàn)考察，還進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)外的實(shí)驗(yàn)考察:輸液配伍混合溶液的不溶性微粒實(shí)驗(yàn)、滲透壓測定、降壓物質(zhì)檢測以及豚鼠過敏實(shí)驗(yàn)。

表1 兩種膠液配方mL

2 結(jié)果

2.1 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)考察過敏物質(zhì)的結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)抗原的測定結(jié)果 見表2。

2.1.2 樣品測定結(jié)果 3個(gè)廠家的76批刺五加注射液吸光度檢測結(jié)果均＜1.322，按照判定標(biāo)準(zhǔn)，所含的過敏性物質(zhì)均在規(guī)定限度范圍內(nèi)，均呈陰性，均符合規(guī)定。不同廠家、同一廠家不同批次之間的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 超濾電泳實(shí)驗(yàn)考察大分子物質(zhì)的結(jié)果 3個(gè)廠家的47個(gè)樣品的電泳結(jié)果比較見表3。

電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:①3個(gè)廠家樣品的原液中都不同程度地殘存一些相對分子質(zhì)量＞10 000的高分子物質(zhì)，經(jīng)過截留相對分子質(zhì)量為10 000的超濾膜后，大分子物質(zhì)明顯減少的為16批(34.0%)，有一定減少的為13 批(27.7%)，無明顯變化的為18 批(38.3%)，說明各廠家都應(yīng)改進(jìn)工藝;②3個(gè)廠家的過濾、超濾工藝的有效性的順序?yàn)?烏蘇里江公司＞多多藥業(yè)公司＞珍寶島公司。

表2 標(biāo)準(zhǔn)抗原的間接酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 超濾后大分子物質(zhì)減少情況的比較

2.3 其他安全性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 熱原、異常毒性以及無菌實(shí)驗(yàn)均符合規(guī)定，輸液配伍混合溶液的不溶性微粒實(shí)驗(yàn)考察、滲透壓測定、降壓物質(zhì)檢測以及豚鼠過敏實(shí)驗(yàn)，均未見異常。

3 討論

常規(guī)的SDS-PAGE電泳對相對分子質(zhì)量＜10 000的物質(zhì)作電泳分離時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果差，而Tris-Tricine SDSPAGE電泳適合分離相對分子質(zhì)量范圍為1～10 000的物質(zhì)［7］。

間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)以空白對照均值加5倍標(biāo)準(zhǔn)差的和作為檢測限判定標(biāo)準(zhǔn)，可控制假陽性結(jié)果。

對3個(gè)廠家共76批樣品還按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了熱原、異常毒性以及無菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定，又進(jìn)行了輸液配伍混合溶液的不溶性微粒實(shí)驗(yàn)考察、滲透壓測定、降壓物質(zhì)檢測以及豚鼠主動過敏實(shí)驗(yàn)等標(biāo)外方法的實(shí)驗(yàn)考察，也均未見異常。

對刺五加注射液開展的超濾電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)廠家的產(chǎn)品均不同程度地存在相對分子質(zhì)量＞10 000的大分子物質(zhì)。推測這些大分子物質(zhì)可能是導(dǎo)致患者發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的原因。

間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)未檢出刺五加抗原，可能是由于實(shí)驗(yàn)采用的樣品原液成分復(fù)雜，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議今后將樣品原液進(jìn)行超濾，再對得到的截留大分子物質(zhì)作間接酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步確證大分子物質(zhì)是否為過敏物質(zhì)。

［1］符壯.我院刺五加注射液不良反應(yīng)分析［J］.中國藥房，2008，19(3):222－223.

［2］楊軍，陳蓮珍.刺五加注射液致不良反應(yīng)119例分析［J］.山西醫(yī)藥雜志，2008，37(8):729－730.

［3］肖樹雄，李泳雪.中藥注射液安全性問題及質(zhì)量控制探析［J］.中國藥師，2009，12(7):955－957.

［4］劉士敬.中藥注射劑不良反應(yīng)原因分析［J］.中國社區(qū)醫(yī)師，2007，23(5):19－20.

［5］于風(fēng)平，胡昌勤，崔生輝，等.刺五加注射液中過敏性雜質(zhì)的分析［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43(5):384－387.

［6］林惠玲，龔海濤，林連成.變態(tài)反應(yīng)性疾病過敏原特異性及總IgE 的檢測［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8(4):580－581.

［7］王旭，何冰芳，李霜，等.Tricine-SDS-PAGE電泳分析小分子多肽［J］.南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(2):79－81.