姜黃素在大鼠體內藥代動力學和生物利用度研究

張立康，汪小珍，李婉姝，邱相君，孫 未，胡國新

(1.溫州醫學院藥學院，浙江溫州 325035;2.溫州醫學院附屬第二醫院，浙江溫州 325027;3.河南科技大學醫學院，河南洛陽 471003)

姜黃素(curcuminoids，Cur)是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學成分，是植物界很稀少的具有二酮的色素［1］。姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化、抗肝細胞毒性、抗風濕、抑菌等廣泛的藥理作用［2－4，9］。

姜黃素在水中溶解度低，血漿半衰期很短［5－6］，血藥濃度低，口服不易吸收，生物利用度低。而具有生物活性的化合物能否在生物體內發揮效應，很大程度上取決于血漿中藥物濃度和生物利用度。曾有文獻報道過姜黃素的口服生物利用度低，但缺乏其具體數據及其它給藥途徑的絕對生物利用度資料。本實驗測定不同給藥途徑下大鼠血漿中姜黃素的濃度，從而研究姜黃素的藥代動力學過程，計算口服以及腹腔注射姜黃素的生物利用度，為姜黃素不同劑型的制備以及臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀為Agilent1100系列，包括G1322A在線脫氣機，G1311A四元泵，G1313A自動進樣器，G1316A溫控箱，G1315B二極管陣列檢測器和 Agilent化學工作站(Rev B.08.04.［1757］)。電子分析天平(AB204-A，梅特勒-托利多上海儀器公司);渦旋混合器(XK96-B，姜堰市新康醫療器械有限公司);氮吹儀(D10型，杭州藍焰科技有限公司)。

1.2 試劑和藥品 甲醇和乙腈為一級色譜純，三氟乙酸(Sigma，064K3647)，乙酸乙酯、氫氧化鈉均為分析純;實驗用水為娃哈哈純凈水。姜黃素對照品(上海融禾醫藥科技有限公司，含量 98.7%，070912);AF2364對照品(美國洛克菲勒大學提供，含量99.6%)。

1.3 動物 21只♂SD大鼠，體質量(230±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

2 方法

2.1 給藥方案

2.1.1 藥液的配制 灌胃給藥溶液:用5%DMSO-玉米油溶解，配制成200 mg·kg－1混懸液，臨用前配制。靜脈給藥溶液:用10%DMSO-生理鹽水溶解，配制成10 mg·kg－1澄清液，臨用前配制。腹腔注射給藥溶液:用10%DMSO-生理鹽水溶解，配制成20 mg·kg－1澄清液，臨用前配制。

2.1.2 給藥與樣品采集 將21只大鼠隨機分成3組，給藥前每組均禁食12 h(不禁水)，分別舌下靜脈(10 mg·kg－1)、灌胃(200 mg·kg－1)和腹腔注射(20 mg·kg－1)給藥。靜脈給藥后分別于5、8、10、15、20、25、35、45、60、120、180 min 尾靜脈取血;灌胃組分別于給藥后 10、15、25、35、45、60、120、180、240、300、360 min 尾靜脈取血;腹腔注射組分別于給藥后 10、15、25、35、45、60、120、180、240 min 尾靜脈取血。采血0.6 ml注入肝素化的試管，離心(3 000 r·min－1)取血漿，－40℃冰凍保存備測。

2.2 對照品溶液的配制

2.2.1 對照品配制 準確稱取姜黃素標準對照品25 mg于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至25 ml，得濃度為1 g·L－1的姜黃素標準儲備液;用甲醇稀釋成濃度依次為100、10、1 mg·L－1的標準工作液(臨用前稀釋)。

2.2.2 內標溶液的配制 準確稱取AF2364標準對照品25 mg于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至25 ml，得濃度為1 g·L－1的 AF2364標準儲備液;用甲醇稀釋成濃度為100 mg·L－1的AF2364內標工作溶液。

2.3 血漿樣品處理 準確吸取待測血漿樣品0.3 ml于 10 ml具塞試管中，加入 100 mg·L－1的AF2364 內標工作液 50 μl，混勻后加入 0.01 mol·L－1氫氧化鈉溶液200 μl。再加入乙酸乙酯3.0 ml，漩渦混勻2 min。轉移上層有機相于另一刻度離心管中，氮吹儀中吹干。用200 μl流動相復溶，取復溶液于自動進樣器的樣品瓶中，設定10 μl進樣檢測。

2.4 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，USA);保護柱:SB-C18保護柱(4.6 mm × 12.5 mm，5 μm，Agilent，USA);流動相:乙腈 ∶水 ∶0.1%TFA=50∶30∶20(V/V/V);流速:1.0 ml·min－1;柱溫:35℃;檢測波長:302 nm(0～5.5 min)，422 nm(5.5～7.5 min)。

2.5 數據分析 采用DAS2.0藥動學軟件處理血藥濃度－時間數據，得到姜黃素的藥代動力學參數，并計算其腹腔注射和口服的絕對生物利用度。

3 結果

3.1 方法專屬性 空白血漿、姜黃素血漿標準品以及大鼠血漿樣品，經HPLC分析測定得到的色譜圖見Fig 1。由圖可見在本實驗條件下，姜黃素與內標能完全分離，血漿中內源性物質不干擾姜黃素和內標的檢測;姜黃素的保留時間為6.7 min，內標的保留時間為4.4 min。

Fig 1 HPLC chromatograms of curcumin

3.2 線性關系及定量下限 配成濃度相當于0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mg·L－1的姜黃素血漿標準品溶液，再按“2.3”項處理后檢測，測定姜黃素峰面積As、內標峰面積Ai，以As/Ai為縱坐標(Y)，以所對應各點濃度C為橫坐標(X)繪制標準曲線。得姜黃素的標準曲線回歸方程為^Y=0.3186X－0.0012(r=0.9998)。定量下限為0.05 mg·L－1(n=6;RSD=5.21%)。

3.3 回收率試驗

3.3.1 相對回收率試驗 配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后檢測。依據標準曲線計算各自的濃度，低、中、高3種濃度的相對回收率分別為(99.29±5.40)%、(104.21±4.72)%、(99.83±1.97)%。

3.3.2 絕對回收率試驗 配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后檢測，記錄姜黃素的峰面積，為血漿標準的峰面積。另取錐底試管6支，兩個一組;每組加入與配制血漿標準品溶液相同的姜黃素標準品溶液，直接吹干后用流動相200 μl復溶，10 μl進樣檢測;記錄不同濃度姜黃素的峰面積，為該濃度的純標準品的峰面積。計算血漿標準的峰面積與純標的峰面積的比值，即為絕對回收率，絕對回收率分別為(77.18±3.48)%、(77.84±1.22)%、(78.25±0.81)%。

3.4 精密度試驗 配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后于同一日內測定，依據當日標準曲線計算檢測量，計算日內精密度;連續3 d同樣操作，計算日間精密度。結果上述方法測得的日內和日間RSD均小于10%，符合生物分析方法指導原則的要求。

3.5 樣品穩定性 配制低、中、高3個濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準溶液，每種濃度3份;經歷3次冰凍－解凍循環后，按“2.3”項處理檢測，考察其穩定性。低、中、高3個濃度的RSD分別為4.92%、4.56%、0.65%，結果顯示凍融條件對血漿樣品的檢測結果沒有明顯的影響。

3.6 藥動學參數和絕對生物利用度 7只大鼠單劑量iv 10 mg·kg－1姜黃素后，血藥濃度－時間曲線見Fig 2A;7只大鼠單劑量ip 20 mg·kg－1姜黃素后，血藥濃度－時間曲線見Fig 2B;7只大鼠單劑量ig 200 mg·kg－1姜黃素后，血藥濃度－時間曲線見Fig 2C。

Fig 2 Mean concentration-time curve of Cur after a single dose of Cur with different administration

血漿藥物濃度經DAS程序處理，姜黃素在大鼠體內iv、ip和ig給藥后的藥代動力學參數見Tab 1。并根據下式計算姜黃素在大鼠體內的絕對生物利用度:F/%=(AUC血管外給藥·D靜脈注射)/(AUC靜脈注射·D血管外給藥)×100%。經計算姜黃素在大鼠體內，口服給藥絕對生物利用度為4.13%，腹腔注射給藥的絕對生物利用度為35.07%。

Tab 1Pharmacokinetic parameters of Cur in three groups(±s)

Tab 1Pharmacokinetic parameters of Cur in three groups(±s)

*P ＜0.05 vs iv(10 mg·kg－1)

Parameter iv/10 mg·kg－1 ip/20 mg·kg－1ig/200 mg·kg －1 T 1.64 ±0.49 10.55 ±0.74 13.16 ±2.17 T 12α/min 1 2 β/min 11.96±2.64 90.79±11.55* 159.28±18.12*V/L·kg－1 0.60±0.28 10.69±1.25 129.27±26.55 CL/L·h－1·kg－1 0.10±0.01 0.28±0.03 2.36±0.37 AUC(0－t)/mg·min·L －1 74.55±9.6 64.10±8.19 73.28±12.48 AUC(0－∞)/mg·min·L －1 104.62±11.89 73.39±8.72 86.36±12.90 Cmax/mg·min·L －1 3.61±0.47 0.95±0.08 0.70±0.050 Tmax/min 5 ±0 14.29 ±1.89 32.14 ±4.88

4 討論

4.1 液相色譜吸收波長的選擇 關于血漿姜黃素的檢測，一般采用 HPLC-UV的方法［7］。姜黃素在整個紫外區均有良好的吸收，二極管陣列檢測器(DAD)三維立體圖顯示，姜黃素的最大吸收波長在426 nm處。本研究使用AF2364做內標，最大吸收波長在302 nm處，故采用DAD波長梯度的功能，在0～5.5 min使用302 nm波長檢測 AF2364，5.5～7.5 min使用426 nm波長檢測姜黃素，獲得了良好的色譜峰。

4.2 藥動學特點 通過靜脈注射、腹腔注射和灌胃3種給藥途徑藥動學結果來看，姜黃素靜脈給藥后，大鼠體內代謝迅速。本實驗結果顯示姜黃素靜脈給藥的消除半衰期為(11.96±2.64)min，與灌胃給藥的消除半衰期(90.79±11.55)min、腹腔注射給藥的消除半衰期(159.28±18.12)min差異均有顯著性(P＜0.05)。同時從藥時曲線分布相可知，靜注后血藥濃度幾分鐘內就迅速下降了幾倍，這可能是姜黃素經靜注后迅速向各臟器分布［8］。大鼠分別經灌胃(200 mg·kg－1)、腹腔注射(20 mg·kg－1)、舌下靜脈(10 mg·kg－1)給予姜黃素后，其Cmax分別為(3.58 ±0.58)mg·L－1、(1.01 ±0.12)mg·L－1、(0.67 ±0.06)mg·L－1，可以為姜黃素在不同給藥途徑下的藥效學研究提供給藥劑量的參考。

4.3 絕對生物利用度 本實驗結果顯示，口服姜黃素的生物利用度達4.13%，腹腔注射姜黃素的生物利用度為35.07%，與文獻報道，姜黃素大鼠口服吸收很低［6］一致。腹腔給藥后，部分姜黃素未被吸收，可能與腹腔內的血流量有關，也可能是非水溶液在腹腔內局部滯留、吸收緩慢;腹腔給藥后的AUC明顯大于灌胃給藥AUC，說明姜黃素口服后極少原形吸收入血，可能是首過效應的影響或者是由于姜黃素的結構特點難以經過腸道吸收。由于姜黃素口服生物利用度低，而腹腔注射生物利用度明顯高于口服，所以可以通過改變姜黃素的劑型，改為注射液，以增加其活性成分的吸收率。

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