預先給予酪氨酸激酶抑制劑IPTRK3對神經源性疼痛的影響

馬偉英，何惠燕，紀風濤，劉 玲，梁建軍，廣瀨宗孝，曹銘輝

(中山大學孫逸仙紀念醫院1.麻醉科、2.消毒供應中心，廣東 廣州 510120;3.福井大學醫學部麻醉和復蘇科，福井910-1193，日本)

神經源性疼痛是臨床上常見的難治性疼痛，目前尚沒有安全有效的藥物［1］。研究發現，局部或系統注射神經生長因子(nerve growth factor，NGF)可引起痛覺過敏和異常疼痛。NGF主要作用于其高親和力受體——酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)，增加TrkA磷酸化水平，致敏并上調傷害性感覺神經元如瞬時感受器電位香草酸受體1(Transient receptor potential vaniloid 1，TRPV1)，激活下游的傷害性因子，參與神經源性疼痛形成，有研究表明給予NGF或TrkA拮抗劑可以阻斷這一過程，減輕神經源性疼痛［2］。實驗證明IPTRK3(一種新合成的細胞穿透肽)可以抑制NGF引起的PC12細胞TrkA磷酸化以及TRPV1的表達增加，但對與TrkA具有同源性的胰島素受體和表皮生長因子受體磷酸化無明顯影響，是特異性的TrkA抑制劑［3］。動物實驗也發現IPTRK3可明顯抑制背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)TRPV1 表達增加，減輕炎性疼痛［4］。我們前期的研究發現，部分坐骨神經結扎引起的神經源性疼痛小鼠術后7 d腹腔單次注射IPTRK3可明顯緩解熱、機械痛覺過敏24 h［5］。Fos蛋白是原癌基因c-fos的表達產物，是檢測鎮痛藥物鎮痛效果的常用神經元標志物［6］。有研究表明在疼痛刺激之前給予鎮痛藥可以減輕手術刺激所致的中樞神經元興奮，以達到術后鎮痛目的［7］。本實驗通過建立小鼠神經源性疼痛模型，術前單次腹腔注射IPTRK3，觀察IPTRK3對小鼠疼痛行為的治療作用，及對DRG內TRPV1蛋白及脊髓背角Fos蛋白表達的影響，探討預先給予 IPTRK3治療神經源性疼痛的效果及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 72只♂ ddy小鼠，體質量25～35 g，由廣東省動物實驗中心提供，4只一籠，動物在12:12 h的黑夜/白晝環境中飼養，避免強光及噪音刺激，自由攝取水和食物。實驗小鼠隨機分為3組(每組24只):①假手術組(sham):腹腔單次給予PBS，10 min后切開暴露坐骨神經，然后依次縫合肌肉皮膚;② 部分坐骨神經結扎(partial sciatic nerve ligation，PSNL)組:腹腔單次給予PBS，10 min后行PSNL;③ IPTRK3組:腹腔單次給予 IPTRK3(10 mg·kg－1)，10 min后行 PSNL術。各組隨機取12只小鼠于不同時間點測疼痛行為學，隨機取6只于術后2 h取新鮮的L4-5DRG用Western blot檢測DRG內TRPV1蛋白表達水平變化，其余6只于術后2 h灌流，取脊髓用于免疫組織化學檢測脊髓背角Fos陽性神經元的數目。

1.2 試劑材料 IPTRK3由日本大阪肽研究所合成;七氟醚(江蘇恒瑞醫藥有限公司);多克隆兔抗Fos抗體(Calbiochem，Darmstadt，德國);多克隆兔抗TRPV1(Neromics，Edina，MN，美國);羊抗兔 HRP IgG 二抗(Vector Laboratories，Burlingame，CA，美國);痛行為測定儀(Ugo Basile，Comerio，意大利)。

1.3 動物模型制作 參照Seltzer等［8］的方法:小鼠采用5%七氟醚誘導30 s，2%的七氟醚維持麻醉，手術過程約3～5 min。在無菌操作下，股段高位暴露左側坐骨神經。在坐骨神經干向后二頭肌和半腱肌分支處的遠端小心地將神經背側與周圍組織分離，用小止血鉗夾住神經背側，將一條8-0號硅制絲線縫入神經干內，結扎神經背側1/3～1/2。sham組只作暴露坐骨神經，不予結扎。依次縫合皮膚肌肉。

1.4 疼痛行為學測量 小鼠分別于給藥前(pre)和給藥后 2、8、24、48、72 h測定左后爪的熱敏縮足反射閾值(paw withdrawal latency，PWL)和機械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal threshold，PWT)。PWL:儀器發射紅外光(落在足底的光圈直徑為5 mm)照射小鼠左足底，安靜小鼠逃避性抬腿時，記錄開始照射至出現縮足逃避反射時間(s)。重復3次，間隔10 min，取平均值用于統計分析。為防止小鼠足底灼傷，紅外光照射最長時間設為20 s。PWT:采用足底機械痛敏測定儀測定各組小鼠PWT值，于安靜小鼠左后足底加壓至逃避性抬腿，記錄開始加壓至出現縮足逃避反射壓力數值(g)，重復3次，間隔10 min，取平均值。

1.5 TRPV1蛋白印跡法 乙醚麻醉后，迅速打開椎管，取左側L4～L5背根神經節，立即置入液氮中保存。向組織中加入蛋白裂解液(1 ml蛋白裂解液加10 μl蛋白酶抑制劑)，超聲裂解組織，低溫離心機中15 000×g離心30 min取上清。BCA法測定樣品的蛋白含量，用8%SDS-聚丙酰胺凝膠分離蛋白，30 μg/well樣品蛋白100 V電泳。然后將蛋白轉移到 NC膜，轉膜電壓為100 V，時間90 min。5%的脫脂奶粉溶液封閉1 h，多克隆兔抗TRPV1(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3次，HRP標記二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗3次，ECL曝光，高敏感X線片顯色。同樣方法測定內參βactin蛋白表達。用program Image J(version 1.35)進行相對灰度值分析。

1.6 Fos蛋白免疫組織細胞化學染色法 采用乙醚麻醉，經左心室灌流固定。先用50 ml生理鹽水快速灌流沖洗血液，繼以4%多聚甲醛30 ml持續灌注。取出L4～L5段脊髓，4%多聚甲醛后固定4～8 h，然后20%蔗糖脫水，置4℃冰箱過夜。冰凍連續切片(片厚 40μm)隔5取1，收集在 0.01 mol·L－1PBS緩沖液中。1%H2O2處理30 min，漂洗后5%正常山羊血清封閉1 h，浸入Fos一抗(1∶20 000)，室溫過夜。漂洗后浸入HRP IgG二抗(1∶600)，孵育1 h。漂洗后浸入 ABC復合物，孵育30 min。DAB顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。細胞中有棕褐色或棕黃色顆粒沉積，無論染色深淺，即為Fos陽性細胞。每只小鼠隨機抽取4張切片計數，取其平均值用于統計分析。

1.7 統計學分析 采用SPSS16.0統計軟件分析。服從正態分布的計量資料以±s表示，多組樣本均數間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD法。不服從正態分布的計量資料采用多組樣本的秩和檢驗。

2 結果

2.1 小鼠熱敏、機械縮足反射閾值的變化 各組小鼠術前基礎值及sham組各時間點的PWL和PWT之間無差異(P＞0.05)。與sham組相比，PSNL組PWL和 PWT于術后2 h即出現明顯降低(P＜0.05)。IPTRK3組PWL和PWT比PSNL組明顯增高，并持續至術后72 h，差異有統計學意義(P＜0.05)。見 Fig 1。

Fig 1 Effects of intraperitoneal(ip)injections of IPTRK3 on PSNL-induced thermal and mechanical hyperalgesia(±s，n=12)

2.2 DRG內TRPV1蛋白的表達變化 與sham組相比，PSNL組DRG中TRPV1蛋白表達水平明顯增高。IPTRK3組 TRPV1蛋白含量比PSNL組明顯降低(P＜0.05)，但仍明顯高于 sham組(P＜0.05)。見 Fig 2。

Fig 2 Effects of ip injections of IPTRK3 on the up-regulation expression of TRPV1 in DRG induced by PSNL(±s，n=6)

2.3 脊髓背角Fos蛋白的表達變化 與sham組相比，PSNL組脊髓背角淺層和深層Fos陽性神經元數目均明顯增加(P＜0.05)。與 PSNL組相比，IPTRK3組脊髓背角淺層和深層 Fos陽性神經元明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。見Fig 3，4。

Fig 3 Effects of ip injections of IPTRK3 on increasing protein expression of Fos in the spinal dorsal horn induced by PSNL

3 討論

因神經源性疼痛發生機制復雜，現有的藥物尚不能明顯緩解神經源性疼痛患者的疼痛癥狀，因此尋找新的藥物作用靶點、探索新的鎮痛藥物對治療神經病理性疼痛具有重要意義。在臨床上，病人術后的慢性神經疼痛通常是由急性的手術疼痛和圍術期神經損傷引起的。有研究表明在組織損傷之前給予鎮痛藥物對于術后疼痛是有效的，其主要通過減少有害刺激傳入所導致的外周和中樞敏感化，以抑制神經可塑性變化，從而達到創傷后鎮痛和減少鎮痛藥用量的目的［7］。我們的研究發現預先單次腹腔注射細胞穿透肽IPTRK3 10 mg·kg－1明顯減輕PSNL引起的痛覺過敏，而且這種鎮痛作用可持續至術后72 h，先前的研究在PSNL后7 d單次腹腔給予IPTRK3，鎮痛作用僅可持續 24 h［5］，這些結果提示神經損傷前預先給予IPTRK3鎮痛效果較術后給藥持久。

Fig 4 Effects of ip injections of IPTRK3 on the expression and distribution of Fos-positive neurons in the L4-L5segments of the laminaeⅠ-ⅡandⅢ-Ⅳ(±s，n=6)

既往研究發現對非甾體類或阿片類等傳統鎮痛藥物治療效果不佳的某些疼痛狀態，NGF拮抗劑或TrkA抑制劑具有明顯的治療效果［2］，但是這些藥物往往作用時間較短，需要重復給藥［9］，或者對TrkA缺乏特異性，副作用較大［10］。因此，我們人工合成了IPTRK3，結構為 YGRKKRRQRRR-acp-SRDIYSTDYYR。其中47-YGRKKRRQRRR-57是建立在人類免疫缺陷病毒1型基礎上，可以使IPTRK3穿透細胞膜，與作用靶點更好的結合;而666-SRDIYSTDYYR-676是可與 TrkA結合的氨基酸序列激活環，使IPTRK3可以特異性抑制TrkA的活性。細胞試驗也已經證實IPTRK3可以特異性抑制 TrkA的活性，而且無明顯細胞毒性［3］。NGF是一種親神經性因子，在神經系統發育過程中參與中樞和周圍神經的發育、存活和維持。但在成熟的機體NGF表達增加并激活其受體TrkA卻是誘發痛覺過敏的重要原因之一。NGF結合細胞膜上的TrkA受體后，首先激活局部的TRPV1使神經元興奮性增加，然后啟動酪氨酸激酶信號傳遞系統，迅速使細胞內TRPV1、P物質、BDNF等蛋白表達增加，放大疼痛效應［2］。TRPV1主要分布于背根神經節和三叉神經節中的中、小直徑神經元，是初級感覺神經元外周末端傷害性刺激的分子整合者。TRPV1可被傷害性熱刺激(＞42℃)、炎癥介質(緩激肽、神經生長因子、組胺)、香草素類化合物(如辣椒堿、RTX)等激活［11］。激活的TRPV1可使鈣離子內流，神經元去極化，產生動作電位，參與痛覺過敏的形成［12］。NGF作用于體外培養的DRG可明顯增強辣椒素誘導的TRPV1活性［13］。本研究結果顯示預先給予IPTRK3后DRG內TRPV1蛋白表達程度與單純手術組相比明顯降低，表明IPTRK3的使用可抑制神經損傷誘導的DRG內TRPV1的表達增加。上述結果提示IPTRK3可能通過抑制TrkA活性，減少TRPV1的表達和轉運，降低神經元的興奮性，從而達到抑制痛覺過敏的作用。

c-fos是一種即刻早期基因，外周傷害性刺激可迅速誘導脊髓內Fos表達增多，是檢測鎮痛藥物鎮痛效果的常用神經標志物。有研究證明坐骨神經部分損傷后1.5～2 h，Fos蛋白表達達到高峰，5 d恢復正常［14］。而使用TrkA抑制劑A77-1726可明顯阻斷IL-13介導c-fos表達［15］。本實驗中腹腔預先給予TrkA抑制劑IPTRK3后2 h已有明顯的鎮痛效應，因此選擇PSNL術后2 h的時間點檢測Fos蛋白表達的改變。發現PSNL術后Fos蛋白表達明顯增加，且主要分布于脊髓Ⅰ～Ⅱ，而給予 IPTRK3后，明顯抑制PSNL誘導脊髓背角淺層Fos蛋白的表達增加。脊髓背角淺層多為傷害性刺激傳入纖維終末，提示除了外周感覺神經系統，在脊髓水平IPTRK3也可以抑制疼痛信號的傳遞，從而產生迅速明顯的抗傷害作用。

綜上所述，本實驗結果顯示，預先給予IPTRK3減輕PSNL動物疼痛行為的表現，對神經病理性疼痛具有一定的治療作用。其機制可能是通過抑制TrkA激活、減少DRG內TRPV1蛋白及脊髓背角Fos蛋白的表達，從外周和中樞同時抑制傷害性刺激信息傳遞從而發揮迅速的鎮痛作用。

［1］ O'Connor A B.Neuropathic pain:a review of the quality of life impact，costs，and cost-effectiveness of therapy［J］.Pharmacoeconomics，2009，27(2):95 －112.

［2］ Hefti F F，Rosenthal A，Walicke P A，et al.Novel class of pain drugs based on antagonism of NGF［J］.Trends Pharmacol Sci，2006，27(2):85－91.

［3］ Hirose M，Takatori M，Kuroda Y，et al.Effect of synthetic cellpenetrating peptide on TrkA activity in PC12 cells［J］.J Pharmacol Sci，2008，106(1):107 －13.

［4］ Ueda K，Hirose M，Murata E，et al.Local administration of a synthetic cell-penetrating peptide antagonizing TrkA function suppresses inflammatory pain in rats［J］.J Pharmacol Sci，2010，112(4):438－43.

［5］ Ma W Y，Murata E，Ueda K，et al.A synthetic cell-penetrating peptide antagonizing TrkA function suppresses neuropathic pain in mice［J］.J Pharmacol Sci，2010，114(1):79 － 84.

［6］ Harris J A.Using c-fos as a neural marker of pain［J］.Brain Res Bull，1998，45:1 －8.

［7］ Cheng K I，Lai C S，Wang F Y，et al.Intrathecal lidocaine pretreatment attenuates immediate neuropathic pain by modulating Nav1.3 expression and decreasing spinal microglial activation［J］.BMC Neurol，2011，11(1):71.

［8］ Seltzer Z，Dubner R，Shir Y.A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury［J］.Pain，1990，43(2):205－18.

［9］ Watson J J，Fahey M S，van den Worm E，et al.TrkAd5:a novel therapeutic agent for treatment of inflammation pain and asthma［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，316(3):1122 －9.

［10］Winston J H，Toma H，Shenoy M，et al.Acute pancreatitis results in referred mechanical hypersensitivity and neuropeptide up-regulation that can be suppressed by the protein kinase inhibitor K252a［J］.J Pain，2003，4(6):329 －37.

［11］王 樂，王蘭蘭，曹 宇.TRPVl對LPS致熱大鼠體溫及下丘腦中Ca2+濃度和cAMP含量的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(1):51－5.

［11］ Wang L，Wang L L，Cao Y.Effect of TRPV1 on LPS-induced fever and the content of Ca2+and camp in hypothalamus in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):51 －5.

［12］王 樂，曹 宇.TRPV1阻斷劑的研究進展［J］.國際病理科學與臨床雜志，2008，28(3):220－4.

［12］ Wang L，Cao Y.Progress in vaniloid receptor1antagonist［J］.Int J Pathol Clin Med，2008，28(3):220－4.

［13］ Bonnington J K，McNaughton P A.Signalling pathways involved in the sensitisation of mouse nociceptive neurones by nerve growth factor［J］.J Physiol，2003，551:433 －46.

［14］ Li X，Clark J D.Heme oxygenase type 2 participates in the development of chronic inflammatory and neuropathic pain［J］.J Pain，2003，4(2):101－7.

［15］石小玉，龔妍春，李文林，等.酪氨酸激酶抑制劑A77-1726阻斷IL-13介導STAT6磷酸化和c-fos表達［J］.中國藥理學通報，2008，24(7):906－10.

［15］ Shi X Y，Gong Y C，Li W L，et al.Tyrosine kinase inhibitor A77-1726 inhibiting STAT6 phosphorylation and c-fos expression induced by IL-13［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):906 －10.