鳳眼草抑菌活性成分的研究

宋玉民，王璞玉，卞常鑫，張 瓊

(西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

鳳眼草(Ailanthusaltissima)為苦木科臭椿屬藥用植物臭椿的果實(shí)，又稱臭椿子、春鈴子，主要分布于浙江、江蘇、湖北、河北、河南、天津、北京、甘肅東南等地，以浙江、河北產(chǎn)量較大。臭椿因具有較好的改善和保護(hù)自然環(huán)境作用，不同部位可入藥且活性較好而受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。臭椿各個部位的化學(xué)成分及其組分的含量略有不同，例如，其干皮和根皮中主要是苦木苦味素類化合物，其次是生物堿類化合物；葉子中主要是黃酮類化合物；果實(shí)中主要是脂肪油類，其次是苦木苦味素類化合物[1]。臭椿根或干的皮稱為槽白皮，又稱椿皮，為《中華人民共和國藥典》收載品[2]。迄今為止，人們對臭椿的干皮和根皮做了大量的研究工作，而對其葉與果實(shí)研究較少。

臭椿的藥理活性多以抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、治療瘧疾等方面為主[3]，具有清熱燥濕、澀腸、止血、止帶、殺蟲等多種功效。早在1966年，美國學(xué)者Beuchat等[4]運(yùn)用酶水解方法從臭椿葉中制備得到葉綠素酸醋，通過比濁法就其對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和熒光假單胞菌的抗菌活性進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠素酸醋具有較好的活性。1969年，俄國學(xué)者從臭椿葉中分離得到一種具有較好抗病毒效果的成分[5]。近年來，我國學(xué)者沈逸萍[6]研究發(fā)現(xiàn)，鳳眼草的水煎煮液對所選的9種菌株均有不同程度的殺菌作用，尤其是對綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的作用較強(qiáng)。趙春超等[7～9]從鳳眼草的水溶液和95%乙醇提取物中提取出了40多種化合物，其中黃酮類和木脂素類化合物具有抗菌性。

作者在此對鳳眼草的95%乙醇提取液進(jìn)行了抑菌活性研究，為進(jìn)一步有效利用鳳眼草資源提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑、菌株與儀器

干鳳眼草，蘭州復(fù)興厚藥材公司。

95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇，均為分析純；營養(yǎng)肉湯，杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、大腸桿菌(E.coil)、金黃色葡萄球菌(S.aureus),中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心。

R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，牛津杯(Φ=8 mm)，石家莊偉天科學(xué)儀器設(shè)備有限公司;TB-85型恒溫器,日本島津公司；LDZX 4OCI型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，上海中安醫(yī)療器械廠；DHG9070A型電熱恒溫干燥箱，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，國華電器；SNCJ LBU型無菌操作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司；DENSIMAT型細(xì)菌電比濁儀，法國生物梅里埃公司。

1.2 提取方法

取干鳳眼草3.5 kg用95%乙醇室溫浸泡7 d，反復(fù)浸泡3次。取上層清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾后得到206.89 g浸膏，浸膏溶解于熱水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反復(fù)萃取3次，得到石油醚提取物112.68 g、氯仿提取物19.95 g、乙酸乙酯提取物13.72 g、正丁醇提取物22.18 g。

1.3 培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)

培養(yǎng)基的制備：300 mL蒸餾水煮沸，按比例準(zhǔn)確加入營養(yǎng)肉湯5.4 g、瓊脂粉6.0 g，加熱煮沸促其溶解，并補(bǔ)足由于蒸發(fā)失去的水分，分裝于10 mL的菌種管中，高壓蒸汽滅菌后制成斜面培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后冷卻到60 ℃，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，水平放置，即得平板培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)好的斜面菌種管內(nèi)加入10 mL無菌水制成菌懸液，用移液槍取200 μL(107cfu·mL-1)菌懸液加入到培養(yǎng)皿中，用無菌刮刀涂布均勻，靜置片刻。

1.4 抑菌性能測試

采用濾紙片法[10]測試4種提取物對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coil)的抑菌活性。將4種提取物分別溶解于相應(yīng)的萃取溶劑中，配制成飽和溶液，將無菌濾紙片(直徑d=6 mm)在其中浸漬，分別置于含上述菌的平板培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑的大小。

最低抑菌濃度(MIC)的測定：稱取10.8 g營養(yǎng)肉湯溶解在600 mL蒸餾水中，煮沸后得到液體培養(yǎng)基；在每支試管中分別加入5 mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，滅菌；采用倍比稀釋法，向第一支試管中加入5 mL 4 mg·mL-1樣品，搖勻后取出5 mL加入第二支試管，混勻后取出5 mL加入第三支試管，依此類推，使每支試管中樣品的濃度(mg·mL-1)分別為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625；分別向每支試管中加入200 μL菌液，置于37 ℃搖床培養(yǎng)18 h后測定MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌圈

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范2002》中對抑菌作用的判斷：抑菌圈直徑>20 mm表示抑菌效果強(qiáng)，抑菌圈直徑在10～20 mm表示抑菌效果中等，抑菌圈直徑<10 mm表示抑菌效果弱，即抑菌圈直徑越大則抑菌活性越高。4種提取物分別對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小見表1。

表1 4種提取物的抑菌圈直徑/mm

由表1可知，對枯草芽孢桿菌，石油醚和氯仿提取物有弱抑菌性，乙酸乙酯和正丁醇提取物有中等抑菌性。對大腸桿菌，石油醚和氯仿提取物有弱抑菌性，乙酸乙酯和正丁醇提取物有中等抑菌性。對金黃色葡萄球菌，石油醚提取物無抑菌性，而氯仿提取物有弱抑菌性，乙酸乙酯提取物有中等抑菌性，正丁醇提取物的抑菌性較強(qiáng)。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度測試結(jié)果見表2。

表2 2種提取物的最低抑菌濃度/mg·mL-1

由表2可知，等量的2種提取物在相同時間內(nèi)對3種菌的最低抑菌濃度不同。乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度最小，為0.125 mg·mL-1；正丁醇提取物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度均為0.25 mg·mL-1。由此得出，乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好，正丁醇提取物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果較好。

3 結(jié)論

對苦木科臭椿屬植物臭椿的果實(shí)鳳眼草(Ailanthusaltissima)的95%乙醇提取液的抑菌性進(jìn)行了研究。利用系統(tǒng)溶劑萃取法得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，以其對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均具有不同程度的抑菌作用，乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好，正丁醇提取物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果較好，為進(jìn)一步有效利用鳳眼草資源提供了依據(jù)。

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[10] 應(yīng)建浙，卯曉嵐，馬啟明，等.中國藥用真菌圖鑒[M].北京:科學(xué)出版社，1987：409-449.