潤(rùn)滑油生物降解菌的篩選

沈齊英，艾 娃，林家柱，王 隆

(北京石油化工學(xué)院化工系，北京 102617)

目前全世界使用的潤(rùn)滑油中，除部分由機(jī)械運(yùn)轉(zhuǎn)正常消耗、部分回收再生利用外，在裝拆、灌注、機(jī)械運(yùn)轉(zhuǎn)過程中仍有4%～10%的潤(rùn)滑油流入環(huán)境，僅歐共體每年就有60萬t潤(rùn)滑油由于各種原因流失在環(huán)境中。以礦物油作基礎(chǔ)油的傳統(tǒng)潤(rùn)滑油產(chǎn)品，在自然環(huán)境中可生物降解能力差、滯留時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境造成破壞。

針對(duì)潤(rùn)滑油造成的環(huán)境污染，世界各國(guó)都相繼進(jìn)行了環(huán)境兼容潤(rùn)滑油的研究，并積極研究石油基潤(rùn)滑油的生物降解。所謂環(huán)境兼容潤(rùn)滑油是指潤(rùn)滑油在滿足機(jī)器工況要求的同時(shí)，潤(rùn)滑油及其耗損產(chǎn)物對(duì)生態(tài)環(huán)境不造成危害或在一定程度上為環(huán)境所容許，即其生態(tài)效應(yīng)合格，其生態(tài)效應(yīng)最主要的指標(biāo)是潤(rùn)滑油的生物降解性。目前為止還沒有一個(gè)普遍接受的測(cè)定潤(rùn)滑油生物降解性的標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)外在潤(rùn)滑油生物降解性測(cè)試方法方面進(jìn)行了大量的研究工作，先后發(fā)展出OECD、CEC-L-33-A-93等較成熟的測(cè)試方法。但用于評(píng)價(jià)潤(rùn)滑油污染環(huán)境的實(shí)際狀況時(shí)還存在一定的不足，因此研究者正在對(duì)上述測(cè)試方法進(jìn)行進(jìn)一步的完善和發(fā)展，同時(shí)也在探索新的測(cè)試方法來評(píng)定潤(rùn)滑油的生物降解性[1～3]。

作者從被石油基潤(rùn)滑油污染的土壤中篩選獲得對(duì)潤(rùn)滑油具有一定降解能力的菌株，并研究了菌株的生長(zhǎng)特性，期望能為潤(rùn)滑油生物降解性的評(píng)價(jià)提供可借鑒的數(shù)據(jù)及方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

菌源取自燕山石化被石油基潤(rùn)滑油污染的土壤；潤(rùn)滑油，燕山石化。

石油醚、葡萄糖和蔗糖，分析純，北京化工廠；苯胺，分析純，北京興津化工廠；蛋白胨、酵母粉和牛肉膏，北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[4]配制。除無機(jī)鹽培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基外，其余的培養(yǎng)基在使用時(shí)均經(jīng)過0.15 MPa、121 ℃的蒸汽滅菌20 min。

AC2型生物安全柜，ESCD公司；sp-3000型紫外分光光度計(jì)，上海光學(xué)儀器廠；LGR10-4.2型冷凍離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SPH-2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DSX-280B型不銹鋼滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 潤(rùn)滑油降解菌的馴化、分離和保存

取5 g被潤(rùn)滑油污染的土壤充分溶于100 mL生理鹽水中，取10 mL接種于90 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基和10 mL潤(rùn)滑油的混合液中，混合液置于恒溫振蕩器中，在120 r·min-1、28 ℃條件下，振蕩培養(yǎng)48 h(1個(gè)周期)；取振蕩培養(yǎng)后水相液體10 mL，重新接種于90 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液和10 mL潤(rùn)滑油的混合液中，在120 r·min-1、28 ℃條件下，振蕩培養(yǎng)48 h；如此重復(fù)7個(gè)周期。

馴化7個(gè)周期結(jié)束后，水相液體以劃線分離的方法進(jìn)行瓊脂平板分離菌種，再置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待瓊脂平板長(zhǎng)出孤立菌落后，將孤立菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱保存[5，6]。

1.2.2 潤(rùn)滑油降解菌的篩選

將保存在斜面培養(yǎng)基上的菌種接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在6000 r·min-1、15 ℃條件下離心分離收集菌體，制備0.5 g·mL-1菌懸液(0.5 g濕菌體懸于1 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中)備用。

取100 mL菌懸液與5 mL潤(rùn)滑油混合，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每24 h用10 mL石油醚萃取混合液的油相，并測(cè)定石油醚萃取液中潤(rùn)滑油的含量。測(cè)得的潤(rùn)滑油量越少，說明菌種降解潤(rùn)滑油的效果越好，即為潤(rùn)滑油降解菌。

苯胺在自然環(huán)境中可被多種微生物降解，故實(shí)驗(yàn)中以苯胺作為陽性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行生物降解實(shí)驗(yàn)，觀察實(shí)驗(yàn)篩選的菌株對(duì)陽性有機(jī)物的降解能力[7]。

1.2.3 潤(rùn)滑油降解菌的生長(zhǎng)特性

選取溫度、pH值、NaCl濃度為主要影響因素設(shè)計(jì)潤(rùn)滑油降解菌培養(yǎng)的正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平

按正交表的設(shè)計(jì)配制培養(yǎng)基，接種相同菌量潤(rùn)滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在690 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌懸液的光密度值。菌懸液的濃度與光密度值成正比，光密度值大者可以認(rèn)為其生長(zhǎng)情況較好。

為了解菌株對(duì)環(huán)境酸堿及鹽濃度的耐受能力，調(diào)節(jié)富集培養(yǎng)基pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，接種相同菌量潤(rùn)滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在690 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌懸液的光密度值。

調(diào)節(jié)富集培養(yǎng)基的NaCl濃度(g·L-1)分別為5、10、15、20、25、26、27、28，接種相同菌量潤(rùn)滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在690 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌懸液的光密度值[8，9]。

1.3 分析與檢測(cè)

潤(rùn)滑油和苯胺含量采用紫外分光光度法測(cè)定。掃描潤(rùn)滑油和苯胺在紫外區(qū)的透過率，可知實(shí)驗(yàn)中使用的潤(rùn)滑油和苯胺均在320 nm波長(zhǎng)處有較好的光吸收。根據(jù)320 nm波長(zhǎng)處吸光度測(cè)定潤(rùn)滑油和苯胺的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 潤(rùn)滑油降解菌的馴化、分離和篩選結(jié)果

以被石油基污染的土壤為出發(fā)菌源、以潤(rùn)滑油為限制性底物，通過增加環(huán)境選擇壓力的方法，馴化、分離、篩選出5株對(duì)潤(rùn)滑油具有一定降解能力的菌株，分別標(biāo)記為RHY-1、RHY-2、RHY-3、RHY-4、RHY-5。菌種在液體培養(yǎng)基中均呈渾濁、懸浮生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，液體培養(yǎng)基的渾濁程度明顯增大。菌種的瓊脂平板形成乳白、濕潤(rùn)、凸起的圓形菌落；革蘭氏染色可見菌體呈桿狀，G-，無芽孢，可初步鑒定為桿菌，其對(duì)潤(rùn)滑油的降解能力見表2。

表2 菌株對(duì)潤(rùn)滑油的降解能力

由表2可知，5菌株對(duì)潤(rùn)滑油均有一定的降解能力，48 h的降解率分別為82.4 %、73.2%、72.6%、60.4%、53.8%，其中菌株RHY-1降解潤(rùn)滑油的能力最強(qiáng)。

由表2還可知，降解48 h時(shí)的降解效率明顯高于24 h。這可能是因?yàn)椋?dāng)降解時(shí)間為24 h時(shí)，降解時(shí)間較短，菌體未能達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。本實(shí)驗(yàn)使用的石油基潤(rùn)滑油基本未作處理，且無機(jī)鹽培養(yǎng)基中除潤(rùn)滑油外無其它碳源，說明降解菌株能夠?qū)κ突鶟?rùn)滑油進(jìn)行生物降解，且有較大范圍的環(huán)境耐受能力。

本實(shí)驗(yàn)以被石油基潤(rùn)滑油污染了的土壤為菌源，采用人工增加微生物生活環(huán)境中石油基潤(rùn)滑油的方法，極大提高了土壤中微生物的選擇壓力，在多數(shù)微生物細(xì)胞被選擇掉的同時(shí)，幸存的微生物細(xì)胞從最初只能耐受石油基潤(rùn)滑油的存在，到最后需要石油基潤(rùn)滑油來維持其生長(zhǎng)繁殖，使微生物產(chǎn)生了新性狀，即獲得能代謝石油基潤(rùn)滑油的菌種。說明加入較高濃度石油基潤(rùn)滑油形成較大的環(huán)境選擇壓力的方法簡(jiǎn)單有效，是獲得新性狀菌種的較好方法。

2.2 潤(rùn)滑油降解菌生長(zhǎng)特性

選取降解潤(rùn)滑油效果最好的菌株RHY-1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與分析見表3。

表3 菌株RHY-1培養(yǎng)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可知,各因素對(duì)菌株RHY-1生長(zhǎng)的影響大小依次為：pH值>溫度>NaCl濃度；菌株RHY-1在溫度為30 ℃、pH值為8.0、NaCl濃度為10 g·L-1的條件下，生長(zhǎng)狀況較好。

菌株RHY-1在不同pH值和鹽濃度下的生長(zhǎng)情況見圖1和圖2。

圖1 菌株RHY-1在不同pH值下的生長(zhǎng)情況

圖2 菌株RHY-1在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)情況

由圖1、圖2可知，菌株RHY-1可生長(zhǎng)的pH值范圍為3.0～11.0，可以耐受的NaCl濃度為27 g·L-1，表明該菌株在環(huán)境pH值和鹽濃度改變較大時(shí)，仍能維持正常的生命活動(dòng)，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)獲得的潤(rùn)滑油降解菌有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。

3 結(jié)論

(1)以被石油基潤(rùn)滑油污染的土壤為菌源，通過馴化、篩選、分離得到具有較強(qiáng)降解石油基潤(rùn)滑油能力的菌株RHY-1；通過溫度、pH值和鹽濃度的3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)及對(duì)環(huán)境pH值和鹽濃度的耐受實(shí)驗(yàn)可知：菌株在溫度為30 ℃、pH值為8.0、NaCl濃度為10 g·L-1的條件下，生長(zhǎng)狀況較好；菌株耐受pH值的范圍為3.0～11.0，可耐受的NaCl濃度為27 g·L-1，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。

(2)采用增加環(huán)境選擇壓力的馴化方法,周期短，限制性底物用量少，獲得菌株降解潤(rùn)滑油效果較好，可以認(rèn)為是一種獲得新性狀菌種的較好方法，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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