應(yīng)用熒光微球技術(shù)進行免疫檢測研究

張燕玲，陳 超，楊 慧，薛小平

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072;2.國家微檢測系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710069)

微球技術(shù)的雛形最早可追溯到20世紀70年代，Horan等采用兩種大小不同的微球在流式細胞儀上同時對兩種抗體進行免疫分析[1]；McHugh等又用4種不同直徑的微球同時檢測血清中相應(yīng)的HIV抗體[2]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，僅靠識別微球大小來檢測，遠遠不能滿足高通量和高靈敏度檢測的需要。近年來，Luminex公司在微球合成過程中加入紅色和橙色熒光染料，通過調(diào)節(jié)兩種熒光染料的比例獲得不同顏色的微球，即給每種顏色的微球一個地址，開發(fā)出熒光可尋址微球(Fluorescent addressable microsphere)，彌補了以往多元檢測模式的不足[3]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的熒光微球技術(shù)(Fluorescent microsphere-based technology)是將聚苯乙烯羧基微球、熒光染料標記系統(tǒng)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)及微球?qū)Ｓ昧魇郊毎麅x等有機整合在一起的一項新技術(shù)，通過熒光微球信號來進行實驗數(shù)據(jù)采集和分析，具有快速分析多重生物反應(yīng)的特點及高靈敏度和特異性，可用于抗原抗體、核酸探針檢測等領(lǐng)域的研究[4，5]。作者在此通過檢測人免疫球蛋白G(IgG)和豬血紅蛋白(Hb)與熒光微球的偶聯(lián)效率，提示熒光微球技術(shù)可應(yīng)用于免疫檢測。

1 實驗

1.1 材料和儀器

111#和172#聚苯乙烯熒光微球、熒光親和素SA-PE，Luminex公司；人免疫球蛋白G(IgG)、生物素化羊抗人IgG(Biotin-羊抗人IgG)、豬血紅蛋白(Hb)、兔抗豬血紅蛋白多克隆抗體(Hb-PcAb)，北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；Biotin-NHS，CALBIOCHEM公司；碳二亞胺(EDC)，PIERCE公司。

Luminex-100TM熒光微球檢測系統(tǒng)，Luminex公司；Millipore MultiScreen Assay System，Millipore公司；8543型紫外可見分光光度計，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 生物素標記Hb-PcAb

將Biotin-NHS溶解于DMSO，加入抗體Hb-PcAb，按VBiotin-NHS∶V抗體=1∶8比例混合避光反應(yīng)，用PBS透析后加入等體積甘油，-20 ℃保存[6]。

1.2.2 紫外可見分光光度計檢測IgG和Hb與熒光微球偶聯(lián)效率

超聲波水浴振散微球后向每管分別加入20 μL 172#和111#微球(172#微球與IgG偶聯(lián)，111#微球與Hb偶聯(lián))，迅速配制50 mg·mL-1的EDC溶液加入微球中，混勻，于室溫避光溫育20 min，PBS清洗微球2次[7]；加入濃度(μg·mL-1)為25、50、100、150、200、250的IgG或Hb溶液各500 μL，紫外可見分光光度計檢測不同濃度IgG和Hb溶液吸光值，記為OD0；空白對照管加入500 μL PBS，混勻，于室溫避光振動溫育2 h后，離心，測上清液吸光值，記為OD1；再用PBS清洗微球2次，離心后測上清液吸光值，分別記為OD2和OD3；最后重懸微球，于4 ℃下避光保存。偶聯(lián)效率由下式計算：

1.2.3 Luminex-100TM檢測IgG和Hb與熒光微球偶聯(lián)效率

將Biotin-羊抗人IgG和生物素標記Hb-PcAb分別按1∶1000、1∶5000、1∶10 000、1∶100 000稀釋，與172#、111#微球各2 μL(約6000個)混合后加入96孔不透光板中，室溫避光溫育30 min，PBS清洗微球2次，然后加入熒光親和素SA-PE(1∶10稀釋)于室溫避光溫育30 min，用Luminex-100TM檢測偶聯(lián)效率，結(jié)果由平均熒光強度(Mean fluorescent intensity，MFI)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見分光光度計檢測蛋白偶聯(lián)效率結(jié)果(表1)

表1 紫外可見分光光度計檢測IgG、Hb與熒光微球偶聯(lián)效率結(jié)果

由表1可看出，IgG和Hb與熒光微球偶聯(lián)效率隨蛋白濃度增大而提高，在100 μg·mL-1時達最大，隨后呈下降趨勢。

2.2 Luminex-100TM檢測蛋白偶聯(lián)效率結(jié)果(圖1、圖2)

圖1 Luminex-100TM檢測IgG與172# 熒光微球偶聯(lián)效率結(jié)果

圖2 Luminex-100TM檢測Hb與111# 熒光微球偶聯(lián)效率結(jié)果

由圖1和圖2可以看出，IgG和Hb在6種濃度梯度下偶聯(lián)所得熒光值均較高，說明熒光微球檢測技術(shù)非常靈敏，偶聯(lián)效率都較為理想；空白1(Blank1)為未偶聯(lián)任何蛋白的空球；空白2(Blank2)為偶聯(lián)Hb和IgG的微球(未加生物素化檢測抗體)，提示這6種濃度梯度對偶聯(lián)效率影響均不大。在保證偶聯(lián)效率較高且不浪費抗原或抗體的前提下，宜選擇100 μg·mL-1作為偶聯(lián)蛋白的濃度。

2.3 討論

目前免疫學(xué)檢測方法有酶擴大免疫測定技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光偏振免疫測定(FPIA)等技術(shù)[8，9]。熒光微球技術(shù)是近年來產(chǎn)生和發(fā)展的一項新技術(shù)，與傳統(tǒng)流式細胞技術(shù)和ELISA等檢測技術(shù)相比，在檢測靈敏度、效率、應(yīng)用范圍等方面具有顯著的優(yōu)越性，隨著微球技術(shù)和生物芯片技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展，將有可能廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)。本研究以人免疫球蛋白G和豬血紅蛋白作為抗體和抗原代表與熒光微球偶聯(lián)，從檢測結(jié)果可以看出熒光微球非常易于與蛋白偶聯(lián)且穩(wěn)定性較好，提示該技術(shù)如應(yīng)用于微生物、細胞因子、興奮劑篩查等各種高通量快速免疫檢測反應(yīng)[10～12]，將具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

以聚苯乙烯羧基熒光微球為固相載體，將人免疫球蛋白G(IgG)和豬血紅蛋白(Hb)分別與微球偶聯(lián)，應(yīng)用Luminex-100TM熒光微球檢測系統(tǒng)檢測抗體IgG和抗原Hb與熒光微球的偶聯(lián)效率。結(jié)果表明，采用100 μg·mL-1抗體或抗原濃度可以獲得較高的偶聯(lián)效率，且檢測快速靈敏。應(yīng)用熒光微球進行抗原抗體免疫檢測可行。

致謝：本研究由國家微檢測系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心資助完成。

參考文獻：

[1] Wood W I，Gitschier J，Lasky L A，et al.Base composition-independent hybridization in tetramethylammonium chloride：A method for oligonucleotide screening of highly complex gene libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA，1985，82(6)：1585-1588.

[2] Iannone M A，Taylor J D，Chen J，et al.Multiplexed single nucleotide polymorphism genotyping by oligonucleotide ligation and flow cytometry[J].Cytometry，2000，39(2)：131-140.

[3] Seideman J，Peritt D.A novel monoclonal antibody screening me-thod using the Luminex-100 microsphere system[J].J Immunol Methods，2002，267(2)：165-171.

[4] Vercammen M，Meirlaen P，Sennesael J，et al.Diagnostic accuracy of the FIDIS multiplex fluorescent microsphere immunodetection system for anti-extractable nuclear antigen(ENA) antibodies in connective tissue diseases[J].Clin Chem Lab Med，2007，45(4)：505-512.

[5] Etienne K A，Kano R，Balajee S A.Development and validation of a microsphere-based Luminex assay for rapid identification of clinically relevant aspergilli[J].J Clin Microbiol，2009，47(4)：1096-1100.

[6] Schliemann C，Roesli C，Kamada H，et al.Invivobiotinylation of the vasculature in B-cell lymphoma identifies BST-2 as a target for antibody-based therapy[J].Blood，2010，115(3):736-744.

[7] Fulton R J，McDade R L，Smith P L，et al.Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system[J].Clin Chem，1997，43(9):1749-1756.

[8] Campos C B，Paim B A，Cosso R G，et al.Method for monitoring of mitochondrial cytochrome C release during cell death：Immunodetection of cytochrome C by flow cytometry after selective permeabilization of the plasma membrane[J].Cytometry A，2006，69(6)：515-523.

[9] Brockman A，Singlam S，Phiaphun L，et al.Field evaluation of a novel colorimetric method——Double-site enzyme-linked lactate dehydrogenase immunodetection assay-to determine drug susceptibilities ofPlasmodiumfalciparumclinical isolates from northwestern Thailand[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48(4)：1426-1429.

[10] Zhong L，Zhang W，Zer C，et al.Protein microarray：Sensitive and effective immunodetection for drug residues[J].BMC Biotechnol，2010，10(1)：12.

[11] 王勤，吳雄飛，王軍霞，等.構(gòu)建腫瘤壞死因子-α免疫微球的實驗研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2005，22(6)：1219-1222.

[12] 翟榮玲，徐懷英，王友令，等.新城疫殼聚糖微球疫苗免疫效果的研究[J].微生物學(xué)報，2007，47(4)：692-696.