甲基化試劑對(duì)螺旋霉素發(fā)酵的影響

羅 俊，高淑紅，陳長(zhǎng)華，葉蕊芳，武 培，賴 珅，馬朝安

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.河南天方藥業(yè)股份有限公司，河南 駐馬店 463003)

螺旋霉素[1](Spiramycin，SPM)是十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)于感染性疾病治療具有臨床應(yīng)用和推廣價(jià)值，在其它領(lǐng)域也有進(jìn)一步拓展的空間。其主要成分為螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)、螺旋霉素Ⅱ(SPMⅡ)、螺旋霉素Ⅲ(SPMⅢ)。根據(jù)干燥標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算，效價(jià)應(yīng)不低于4100 IU·mg-1，其組分要求為：SPMⅠ≤80.0%，SPMⅡ≤5.0%，SPMⅢ≤10.0%；三者的總和應(yīng)不少于90%。

在螺旋霉素發(fā)酵過程中，主要雜質(zhì)UNK4與主要組分SPMⅠ僅差一個(gè)甲基[2]。陳劍鋒等[3]在研究甲基化因子對(duì)西索米星發(fā)酵過程的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)加快甲基化反應(yīng)速率有助于增加西索米星前體物質(zhì)的積累，改變其部分代謝通路，可大大提高發(fā)酵組分。氯化膽堿在代謝中與蛋氨酸和甜菜堿類似，可以提供生物化學(xué)過程所需要的甲基。因此，作者在此研究了在發(fā)酵過程中添加氯化膽堿對(duì)發(fā)酵產(chǎn)螺旋霉素及組分的影響，進(jìn)而優(yōu)化螺旋霉素發(fā)酵的培養(yǎng)條件。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器

FUS-15L型自動(dòng)控制發(fā)酵罐，華東生物技術(shù)工程公司；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科學(xué)儀器研究所；717 Plus-Auto sampler型HPLC分析儀，Waters公司。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

生二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)，河南天方藥業(yè)。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：糊精，黃豆餅粉，玉米漿，酵母粉，豆油，(NH4)2SO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，CaCO3，pH值6.4。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精，黃豆餅粉，玉米漿，酵母粉，豆油，(NH4)2SO4，KH2PO4，NaCl，KCl，Zn2SO4，CoCl2，MgSO4，CaCO3，pH值6.4。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

一級(jí)種子培養(yǎng)：250 mL三角瓶裝量為30 mL，(27±0.5)℃、220 r·min-1培養(yǎng)48 h。

搖瓶發(fā)酵：250 mL三角瓶裝量為25 mL，(27±0.5)℃、220 r·min-1培養(yǎng)6 d。

考察了不同甲基化試劑、氯化膽堿添加條件對(duì)螺旋霉素發(fā)酵的影響。

1.3.2 15 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

將甘油管中的菌種接入500 mL一級(jí)種子瓶(27±0.5)℃培養(yǎng)48 h；按相同接種量接入500 mL二級(jí)種子瓶，同溫培養(yǎng)24 h；再接入15 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)6 d。一罐為對(duì)照罐，即按正常培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵；一罐為條件罐，即在120 h時(shí)添加0.66 g·L-1氯化膽堿。每隔8 h取樣，分別測(cè)定發(fā)酵液的pH值、總糖含量、NH2-N含量、效價(jià)，并根據(jù)所測(cè)參數(shù)調(diào)節(jié)混合料的補(bǔ)加速率?；旌狭贤Ａ蠒r(shí)間一般在120 h左右，選擇在停料之后添加氯化膽堿，不同批次根據(jù)菌體的生長(zhǎng)狀況調(diào)整停料時(shí)間，相應(yīng)的添加氯化膽堿的時(shí)間也可以提前。

1.3.3 分析測(cè)試

總糖和氨氮含量的測(cè)定：采用斐林試劑法和甲醛法[4]。

生物效價(jià)和化學(xué)效價(jià)的測(cè)定：參照2010版中國(guó)藥典，分別采用杯碟法和分光光度法[5]測(cè)定。文中所述效價(jià)均為生物效價(jià)，化學(xué)效價(jià)測(cè)定僅為驗(yàn)證生物效價(jià)測(cè)定結(jié)果。

HPLC法測(cè)定發(fā)酵液的樣品預(yù)處理：取一定量螺旋霉素發(fā)酵液于3000 r·min-1離心10 min，取上清液于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。分析時(shí)取1 mL上清液于10 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm合成纖維素聚酯膜真空過濾后即可直接進(jìn)樣。

HPLC法測(cè)定發(fā)酵組分的色譜條件：流動(dòng)相A為0.035 mol·L-1的乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈-甲醇(5∶1)溶液，流動(dòng)相A和B配制完成后用超聲波脫氣備用；流動(dòng)相速度0.8 mL·min-1；柱溫70℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)232 nm；進(jìn)樣量10 μL；色譜柱：XTerra RP18，5 μm，250 mm×4.6 mm。

HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸的色譜條件：流動(dòng)相為10 mmol·L-1磷酸溶液，用K2HPO4溶液調(diào)節(jié)pH值至2.3±0.1，配制完成后用超聲波脫氣備用；流動(dòng)相速度1 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm；柱溫30℃；色譜柱：XTerra RP18，5 μm，250 mm×4.6 mm。

采用以下3種方法對(duì)發(fā)酵液中的有機(jī)酸組分定性：(1)在相同的色譜條件下，將樣品色譜圖與有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的有機(jī)酸；(2)在樣品中加入有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)峰高的突增來進(jìn)一步驗(yàn)證色譜峰的歸屬；(3)比較各有機(jī)酸在標(biāo)準(zhǔn)液和發(fā)酵液色譜圖中的紫外吸收光譜圖。

有機(jī)酸組分的定量分析：采用HP化學(xué)工作站中HP增強(qiáng)型積分算法進(jìn)行積分，有效控制峰面積測(cè)量的精確度。由HPLC圖譜積分得出對(duì)應(yīng)各個(gè)有機(jī)酸峰的峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到有機(jī)酸濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲基化試劑對(duì)螺旋霉素發(fā)酵的影響

96 h為發(fā)酵產(chǎn)螺旋霉素的高峰期。因此，在96 h時(shí)，向發(fā)酵液中分別添加0.8 g·L-1的甲基化試劑葉酸、甲硫氨酸、VB12、氯化膽堿以及甜菜堿，其對(duì)螺旋霉素發(fā)酵的影響見表1。

表1 甲基化試劑對(duì)螺旋霉素發(fā)酵的影響

由表1可知，氯化膽堿對(duì)螺旋霉素的生物合成有明顯的促進(jìn)作用，葉酸、甲硫氨酸、VB12對(duì)螺旋霉素的生產(chǎn)不利，而甜菜堿對(duì)螺旋霉素促進(jìn)效果不明顯，其價(jià)格也較氯化膽堿昂貴，不利于工業(yè)化大生產(chǎn)。因此，選擇氯化膽堿作為甲基化試劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 氯化膽堿添加條件的優(yōu)化

2.2.1 氯化膽堿的添加時(shí)間

分別在72 h、96 h、120 h時(shí)各添加0.4 g·L-1、0.6 g·L-1、0.8 g·L-1、1.0 g·L-1、1.2 g·L-1的氯化膽堿，以不加氯化膽堿作為對(duì)照，結(jié)果見圖1。

氯化膽堿濃度(g·L-1)，1～5：0.4，0.6，0.8，1.0，1.2；6.對(duì)照

由圖1可知，在發(fā)酵72 h時(shí)添加氯化膽堿，無論添加量多少均會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制作用，然而隨著時(shí)間的推后，這種抑制現(xiàn)象逐漸減弱，到發(fā)酵中后期(96 h)時(shí)，發(fā)酵效價(jià)隨著添加量的增大呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)；到發(fā)酵末期(120 h)時(shí)，促進(jìn)作用很明顯，而且只有在高添加濃度下抑制效應(yīng)才明顯。

2.2.2 氯化膽堿的添加濃度

單因子設(shè)計(jì)(One-factor design，OFD)[6]是一種單因素五水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。它將實(shí)驗(yàn)因素與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似，并將其函數(shù)化，依此研究因素與響應(yīng)值之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，即可得到一元三次方程，該方程表明因子對(duì)響應(yīng)值的影響。

Y=β0+β1x+β2x2+β3x3

(1)

式中：Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值即螺旋霉素的效價(jià)；β為回歸系數(shù)；x為自變量的編碼水平。

運(yùn)用 MyDesign Design Expert 7.0[7]軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按式(1)進(jìn)行方差分析，以得到的復(fù)相關(guān)系數(shù)平方(R2)來表示因子與響應(yīng)值的擬合性質(zhì)，并用F檢驗(yàn)分析顯著水平。對(duì)方程求導(dǎo)，便可得到其極值點(diǎn)，即最優(yōu)化的條件。

采用單因子法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以氯化膽堿的添加濃度為影響因子(A)、螺旋霉素的效價(jià)為響應(yīng)值，在發(fā)酵后期(120 h)添加氯化膽堿，結(jié)果見表2。

表2 氯化膽堿添加濃度的單因子實(shí)驗(yàn)

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，擬合三次方程為：

Y=21372.61+3063.67A-2984.72A2-3850.67A3

(2)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析見表3。

表3 響應(yīng)面立方模型分析

由表3可知，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值小于0.05，說明模型是顯著的，失真值5.08，模型誤差不顯著。表4是對(duì)模型可信度的分析。

表4 模型可行性分析

由表4可知，信噪比為19.136(軟件認(rèn)為該值大于4即表示模型的可信度較高)，表明該模型能用于指導(dǎo)設(shè)計(jì)適合的實(shí)驗(yàn)范圍，R2=0.9850，表明該因素及其多次項(xiàng)能解釋Y變化的98.5%，模型擬合程度較好。

通過軟件分析，得到氯化膽堿的最優(yōu)添加濃度為0.66 g·L-1，預(yù)計(jì)效價(jià)可達(dá)21 921 U·mL-1。

綜上所述，氯化膽堿最優(yōu)的添加條件為：添加時(shí)間為120 h，添加濃度為0.66 g·L-1。添加氯化膽堿后，對(duì)螺旋霉素生產(chǎn)有促進(jìn)作用，搖瓶效價(jià)提高15%左右。

2.3 氯化膽堿對(duì)搖瓶發(fā)酵組分的影響

在120 h時(shí)添加濃度為0.66 g·L-1的氯化膽堿，以未添加的作為對(duì)照，兩組實(shí)驗(yàn)分別做5次重復(fù)，取平均值，結(jié)果見表5。

表5 氯化膽堿對(duì)發(fā)酵組分的影響/%

由表5可知，添加氯化膽堿之后，各主要雜質(zhì)含量均有不同程度的降低，而有效組分SPMⅠ的含量也相應(yīng)有所提升，達(dá)到了預(yù)期效果。

2.4 氯化膽堿對(duì)15 L發(fā)酵罐螺旋霉素發(fā)酵過程參數(shù)的影響

2.4.1 對(duì)總糖、氨氮含量的影響(圖2)

圖2 添加氯化膽堿后總糖與氨氮的走勢(shì)

由圖2可知，兩批罐采用同種生產(chǎn)工藝控制，兩批罐的總糖、氨氮含量走勢(shì)基本一致。

2.4.2 對(duì)pH值、效價(jià)的影響(圖3)

圖3 添加氯化膽堿后pH值與效價(jià)的走勢(shì)

由圖3可知，在120 h添加氯化膽堿后，條件罐pH值快速下降，在128 h后趨于穩(wěn)定，pH值穩(wěn)定在5.9左右；而對(duì)照罐pH值則變化不大，穩(wěn)定在6.2左右，這可能和氯化膽堿是弱酸性溶液有關(guān)。

由圖3還可知，進(jìn)入生產(chǎn)末期后，對(duì)照罐的效價(jià)增長(zhǎng)速度逐漸放緩，而條件罐在添加氯化膽堿后，效價(jià)一直穩(wěn)步提升。

2.4.3 對(duì)螺旋霉素組分時(shí)序性的影響(表6)

表6 氯化膽堿對(duì)螺旋霉素時(shí)序性的影響

由表6可知，在120 h添加0.66 g·L-1氯化膽堿后，各主要雜質(zhì)組分的含量均有一定程度的降低，其中雜質(zhì)UNK4的含量變化顯著，由對(duì)照罐的2.11%降至1.18%，其它雜質(zhì)UNK2由6.57%降至6.35%、雜質(zhì)B由1.17%降至0.55%，對(duì)應(yīng)的有效組分SPMⅠ的含量由85.56%提升至89.98%。

2.4.4 對(duì)代謝過程中有機(jī)酸的影響(圖4)

圖4 發(fā)酵過程中有機(jī)酸濃度的變化趨勢(shì)

由圖4可知，補(bǔ)加氯化膽堿后，與對(duì)照罐相比，條件罐的丙酮酸濃度降低，丙酸濃度基本不變，檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、蘋果酸以及乙酸濃度均有不同程度的提高，其中檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及蘋果酸均為TCA循環(huán)中的重要代謝中間產(chǎn)物，它們均有不同程度的積累，說明氯化膽堿的加入有助于增大TCA循環(huán)通量。

葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞以后，首先經(jīng)過EMP代謝途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸后，才能進(jìn)一步進(jìn)入TCA循環(huán)，丙酮酸濃度的變化一定程度上可以反映菌體對(duì)糖的利用情況。胞內(nèi)生成的丙酮酸主要轉(zhuǎn)化為乙酰CoA和草酰乙酸，丙酮酸濃度的降低說明該轉(zhuǎn)化向草酰乙酸進(jìn)行，而草酰乙酸為生成丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的主要底物，不僅提供了內(nèi)酯環(huán)合成所需要的三碳前體，同時(shí)還能緩解底物抑制效應(yīng)，使多余的二碳前體(如乙酰CoA和丙酰CoA)能夠在酰基羧化酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA，促進(jìn)大環(huán)合成，提高生物效價(jià)。

3 結(jié)論

通過添加甲基化試劑，使得搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生螺旋霉素的產(chǎn)量和發(fā)酵液中有效組分含量得到了提高。氯化膽堿的最優(yōu)添加時(shí)間為120 h、最優(yōu)添加濃度為0.66 g·L-1，此條件下螺旋霉素效價(jià)提高約15%，各主要雜質(zhì)的含量均有一定程度的降低，其中UNK4的含量變化最顯著，而有效組分的含量相應(yīng)有所提升。

同樣條件下，在15 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)中添加氯化膽堿，各主要雜質(zhì)組分的含量均有一定程度的降低，其中雜質(zhì)UNK4變化最顯著，由對(duì)照罐的2.11%降至1.18%，有效組分的含量也由85.56%提升至89.98%。

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