2，4-二氯苯酚與人血清白蛋白相互作用的研究

王 洋，陳艷萍，張業中

(長江大學化學與環境工程學院，湖北 荊州 434023)

氯酚類化合物被廣泛用作防腐劑、防銹劑、除草劑及農藥，在水中的溶解度大，結構穩定，不易分解和轉化，它們在自然界中不斷積累，給自然環境造成較大危害，已被美國環保局和我國列為優先控制污染物[1]。2，4-二氯苯酚(DCP)是氯酚類化合物的一個典型代表，作為一種重要的有機中間體，DCP能通過食物鏈在動物體內不斷積累，對人體、動植物等具有很強的毒性、致癌性及突變性，因此，對氯酚類化合物的研究日益引起人們的關注[2]。

人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，由585個氨基酸殘基組成，具有存儲和轉運內源性代謝產物和外源性藥物小分子的重要生理功能。藥物分子進入血液后不同程度地與人血清白蛋白結合，可以控制藥物的釋放和代謝。因此，研究二者的相互作用對于了解藥物在人體內的儲存、運輸、吸收、分布及代謝進程，闡明血清白蛋白與藥物小分子相互作用的本質具有重要的指導意義[3，4]。作者利用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、圓二色譜法和三維熒光光譜法等方法研究DCP與HSA的相互作用，獲得其相互作用機理、結合常數，并考察了DCP與HSA結合后HSA構象的變化。

1 實驗

1.1 試劑及儀器

2，4-二氯苯酚(溶液濃度1.0×10-3mol·L-1)，上海國藥集團化學試劑有限公司；2.0×10-6mol·L-1HSA溶液，Sigma公司；Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.40)；所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，經檢測均無熒光雜質。

LS-55型熒光分光光度計，美國PE公司；J-810型圓二色譜儀，日本Jasco公司；TU-1901型紫外可見分光光度計，北京普析分析儀器公司；AY-120M型電子分析天平，日本島津公司；SYC-15型超級恒溫水浴(控溫精度±0.1℃)，南京桑力電子設備廠。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜

測定條件：激發波長λex為285 nm、激發狹縫寬度為15 nm、發射狹縫寬度為4.0 nm。在模擬人體生理條件下，用微量進樣器加入不同量的DCP溶液，測定其與HSA相互作用的熒光猝滅圖譜，記錄波長在300～450 nm范圍內的熒光光譜。

1.2.2 紫外吸收光譜

測定條件：石英比色皿光路長為1.0 cm，測定200～320 nm波長范圍內的紫外吸收光譜。

1.2.3 圓二色譜

測定條件：比色杯光路長為0.1 cm，掃描速度為200 nm·min-1。在pH值為7.40、持續氮流的條件下測定190～270 nm波長范圍內HSA與DCP作用前后的圓二色譜圖，通過Jasco′s Spectra Manager MT軟件來控制。在相同實驗條件下，作為參照物的緩沖溶液從樣品光譜中扣除。圓二色譜的測量結果用平均摩爾橢圓率(MRE)表示，單位為degree·cm2·dmol-1。游離的和結合的蛋白質中，α-螺旋結構的含量根據208 nm處的MRE值依下式計算[5]：

式中：MRE208為208 nm處觀測到的MRE值；4000為208 nm處β-折疊和無規卷曲構象的MRE值；33000為208 nm處純α-螺旋結構的MRE值。

1.2.4 三維熒光光譜

測定條件：初始激發波長為200 nm，每隔5 nm記錄一次200～500 nm之間的發射光譜，掃描31次，其它參數與熒光猝滅光譜的參數相同。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅機制和猝滅常數

熒光猝滅過程分為動態猝滅和靜態猝滅，它們可以從溫度影響、粘度影響或熒光壽命等方面加以區分。研究表明，對于靜態猝滅過程，其猝滅常數隨溫度的升高而減小；相反，動態猝滅常數隨溫度的升高而增大。

不同濃度的DCP與HSA作用時的熒光發射光譜如圖1所示。

由圖1可知，當激發波長為285 nm時，HSA在350 nm處有一個強的熒光發射峰，隨著DCP濃度的增大，HSA的熒光發射光譜的峰形不變，峰位出現輕微藍移，熒光強度規律性地降低，說明DCP對HSA的熒光有猝滅作用。

為了判斷DCP對HSA的猝滅機制，用Stern-Volmer[6]方程[式(1)]分析4個溫度(292 K、298 K、304 K、310 K)下的熒光猝滅數據：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中：F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時生物大分子的熒光強度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數；[Q]為猝滅劑的濃度；Kq為生物大分子的猝滅速率常數，它反映了體系中分子的彼此擴散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響；τ0為不存在猝滅劑時熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[7]。

以F0/F對[Q]作圖(如圖2所示)，根據方程(1)算出4個溫度下的猝滅常數，結果列于表1。

圖2 4個不同溫度下的Stern-Volmer關系圖(pH=7.40)

表1 4個不同溫度下 DCP與 HSA相互作用的Stern-Volmer猝滅常數(pH=7.40)

由表1可知，KSV隨溫度的升高呈減小趨勢，并且4個溫度下相應的Kq值都遠大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅速率常數(2.0×1010L·mol-1·s-1)[8]。這初步表明DCP對HSA的熒光猝滅為形成復合物所引起的靜態猝滅。

動態猝滅只影響熒光分子的激發態，不會改變熒光體的吸收光譜，而在靜態猝滅過程中，基態配合物的形成會導致熒光體吸收光譜的改變。所以通過觀察加入藥物前后HSA吸收光譜有無改變，可以判別猝滅類型。分別測定DCP、HSA和DCP-HSA的紫外可見吸收光譜，見圖3。

A.c(DCP)= 2.0×10-6mol·L-1 B.c(HSA) = 2.0×10-6mol ·L-1 C.c(HSA)=c(DCP)=2.0×10-6mol·L-1(1∶1)

由圖3可知，HSA的吸收光譜在加入DCP前后明顯不同(曲線B和曲線C)，進一步證明DCP對HSA的猝滅過程為靜態猝滅。

對于靜態猝滅，可用修正的Stern-Volmer方程[9][式(2)]對猝滅數據作進一步分析：

F0/(F0-F)=1/(faKa[Q])+1/fa

(2)

式中：(F0-F)為加入猝滅劑前后熒光強度的差值；fa為熒光基團可接近猝滅劑的部分(分數)；Ka為有效猝滅常數，它近似于DCP-HSA相互作用的結合常數。

以F0/(F0-F)對1/[Q]作圖，如圖4所示，根據方程(2)算出4個溫度下的有效猝滅常數，結果列于表2。

圖4 4個不同溫度下修正的Stern-Volmer曲線(pH=7.40)

表2 修正的Stern-Volmer方程的有效猝滅常數與DCP-HSA體系的相關熱力學參數

比較表1和表2數據可知，Ka隨溫度的變化趨勢與KSV一致，說明DCP與HSA的結合過程確實為生成復合物的靜態猝滅過程。

2.2 DCP與HSA的結合模式

一般說來，小分子與生物大分子間的作用力主要包括疏水作用力、氫鍵、范德華力、靜電引力等[10]。假如焓變(ΔH)在所研究的溫度范圍內變化不大，其值可近似為常數，于是熵變(ΔS)可由van′t Hoff方程[式(3)]求出：

lnK=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R

(3)

式中：K為相應溫度下的結合常數；R為氣體常數。

以lnK對1/T作圖(如圖5所示)，由斜率可求出焓變(ΔH)，由截距可求出熵變(ΔS)。反應的自由能變ΔG由式(4)計算：

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(4)

圖5 HSA與DCP相互作用的范特霍夫曲線

各熱力學參數的計算結果列于表2。從表2可知，ΔGθ<0，說明該反應是自發過程。Ross等[11]從大量蛋白質和藥物反應實驗中總結出了熱力學參數值與作用力類型間的聯系：ΔH>0、ΔS>0為典型的疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0為氫鍵和范德華力；ΔH<0、ΔS>0為靜電引力。由焓變(-6.336 kJ·mol-1)和熵變(75.12 J·mol-1·K-1)的值可知，DCP與HSA分子間主要作用力為靜電引力。

2.3 DCP在HSA上結合位置的確定

HSA分子中有三個相似的結構域，分別稱為結構域Ⅰ、結構域Ⅱ、結構域Ⅲ，每個結構域又可分為A、B兩個子域。其中結構子域ⅡA和ⅢA又被稱作SiteⅠ和SiteⅡ，它們是大多數藥物特異性的強結合位點[12]。在SiteⅠ結合的藥物通常是電荷位于分子中央的環狀結構的陰離子，在SiteⅡ結合的藥物通常是電荷位于分子末端的鏈狀分子，如脂肪酸等。DCP由于分子中存在較大的共軛體系，電荷分布在共軛體系的環上，故其結合在HSA上SiteⅠ位點的可能性較大。研究表明，華法林(Warfarin)常作為HSA上SiteⅠ的位點標記物[13]。進行了DCP與HSA-Warfarin相互作用的位點競爭實驗，結果如圖6所示。

T=298 K；λex=320 nm；c(HSA) = 2.0×10-6mol·L-1；c(Warfarin) =5.0×10-6mol·L-1；c(DCP) (×10-5mol·L-1)，A～I：0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6

由圖6可知，當激發波長為320 nm(華法林的最大吸收峰處的波長)時，Warfarin在390 nm附近有一個強的熒光發射峰，而DCP和HSA在390 nm附近的熒光強度幾乎為零。當向Warfarin溶液中加入HSA溶液時，Warfarin的熒光強度急劇增強，且最大發射波長明顯藍移(曲線A)。隨著DCP不斷加入HSA-Warfarin混合溶液中，該體系的熒光強度逐漸降低且最大發射波長紅移(曲線B～I)。這表明，隨著DCP的加入，體系的熒光圖譜逐漸向著只含有Warfarin時的熒光圖譜靠近。即DCP取代了Warfarin在HSA上的結合位點，說明DCP在HSA上的結合位置為SiteⅠ。

2.4 DCP對HSA構象的影響

2.4.1 圓二色譜

DCP對HSA二級結構的影響可以用圓二色譜研究。測定室溫條件下HSA和DCP-HSA體系的圓二色譜，并用MRE值來分析圓二色譜可以求出HSA中α-螺旋結構的含量，結果見圖7。

c(HSA) = 2.0×10-6mol ·L-1；c(DCP)(×10-6mol·L-1)，A～C：0，8.0，20.0

由圖7可知，在209 nm和222 nm處出現了兩個負的特征肩峰譜帶，這是HSA中α-螺旋結構的特征峰[14]。游離態的HSA中，α-螺旋結構含量為58.85%，當HSA與DCP的濃度比達到1∶10時，α-螺旋結構含量降至54.24%，說明DCP與蛋白質多肽主鏈的氨基酸殘基結合，破壞了蛋白質的氫鍵網，使HSA的二級結構有所伸展。雖然DCP的加入導致HSA兩個負的肩峰帶強度減小，但峰形和峰位并未改變，表明DCP雖對HSA的二級結構有一定的影響，但α-螺旋結構仍占主導地位。

2.4.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅可以全面展現待測樣品的熒光信息，還可以用來研究蛋白質構象的變化。圖8為HSA和DCP-HSA體系的三維熒光光譜，相關的特征參數列于表3。

圖8中，峰a是瑞利散射峰(λex=λem)[15]，加入DCP后其熒光強度有所增加，原因可能是DCP-HSA復合物的生成導致溶液中溶質的粒徑增大，散射效應增強。峰b是二級散射峰(λem=2λex)。峰1(λex=285.0 nm，λem=349.0 nm)顯示了色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為，是研究熒光猝滅時的主熒光峰。峰2(λex=230.0 nm，λem=347.5 nm)是一個新的強熒光峰，它揭示了蛋白質多肽鏈結構的熒光特性，其熒光強度與蛋白質二級結構的變化密切相關[15]。

c(HSA) (×10-6mol·L-1)，A：2.0，B：2.0；c(DCP) (×10-6mol·L-1)，A：0，B：2.0

表3 HSA和DCP-HSA復合物的三維熒光光譜特征

從表3可以看出，加入DCP前后峰2的熒光強度發生了明顯猝滅，表明加入DCP后，蛋白質的二級結構發生了很大改變，該結論與圓二色譜的分析結果相符。由此可以得出：DCP與HSA的相互作用使蛋白質的多肽鏈更加舒展，構象發生改變，以前包埋在圓筒內的疏水腔暴露出來，即DCP與HSA的相互作用使HSA的構象和微環境發生了改變。

3 結論

用一系列熒光方法對DCP與HSA相互作用進行了分析。由熒光光譜和紫外可見吸收光譜分析可知，該反應是形成復合物的靜態猝滅過程。根據van′t Hoff方程求得的不同溫度下的熱力學參數推斷出靜電引力是維持DCP-HSA復合物穩定的主要作用力。ΔGθ<0，表明該反應能自發進行。此外，DCP在HSA的SiteⅠ位發生了較強的結合。圓二色譜和三維熒光光譜分析發現，加入DCP之后，HSA中α-螺旋結構的含量減少，肽鏈有所伸展，HSA的構象和所處微環境發生了變化。

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