辣根過氧化物酶催化合成水溶性導電聚苯胺的研究

白利杰，陳建波

(上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234)

自1977年首次發(fā)現(xiàn)摻雜碘的聚乙炔具有金屬特性以來，導電聚合物受到了廣泛關注。其中聚苯胺(PANI)由于結構多樣、摻雜機制獨特、穩(wěn)定性高、應用前景廣闊更是備受矚目[1]。傳統(tǒng)的聚苯胺合成方法有化學合成法和電化學合成法，但均存在因過氧化導致副產(chǎn)物較多的缺點。此外，聚苯胺在普通的有機溶劑和溶液中的溶解性很低，也限制了它在工業(yè)中的應用，因此人們致力于尋求更好的催化方式[1，2]。酶因為具有較高的催化效率及對底物高度的專一性，且其催化的聚合過程溫和、環(huán)保，產(chǎn)物容易分離，副產(chǎn)物很少，因而酶催化在高聚物合成領域越來越受到人們的關注。目前已經(jīng)應用于導電聚苯胺合成研究的生物酶包括辣根過氧化物酶(HRP)、漆酶、棕櫚樹過氧化物酶等[3～5]。

辣根過氧化物酶(HRP)是一種以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白，在H2O2存在時能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合，由于穩(wěn)定性較好、價廉，已被廣泛應用于聚合物的合成。但是在一般條件下HRP酶催化苯胺聚合過程中會得到低分子量的寡聚體，這些由于快速聚合形成的非導電性的寡聚體因不溶于水而很快沉淀出來。這一問題可以通過引入聚陰離子模板來解決。聚陰離子模板能夠促進苯胺單體的頭尾連接，從而使高分子量的苯胺聚合物能夠在水溶液中存在。文獻報道可作為酶催化苯胺聚合模板的有聚苯乙烯磺酸鈉(SPS)、聚乙烯磷酸鹽(PVP)、磺化木質(zhì)素(LGS)及 DNA(RNA)等[3，6～8]。

在酶催化制備導電聚苯胺過程中，酶不可避免地會受到體系中各種條件的影響，酶催化活性的變化最終影響導電聚苯胺的合成。目前，文獻報道多側重導電聚苯胺的合成，而對生物酶的變化研究較少，因此，對生物酶在催化導電聚苯胺合成過程中性質(zhì)的變化并不十分清楚。為拓展酶催化導電聚苯胺的研究，作者以十二烷基硫酸鈉(SDS)為模板，研究了在SDS膠束溶液中HRP催化聚合導電聚苯胺的影響因素，并對合成過程中HRP性質(zhì)的變化進行了探索。

1 實驗

1.1 試劑

辣根過氧化物酶，上海Kayon生物試劑公司；苯胺，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，純度≥99%，Sigma；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 聚合反應

用pH值為1.0～4.0的緩沖溶液配制一定濃度的SDS溶液，加入10 mmol·L-1的苯胺單體和0.1 mL 10 mg·mL-1HRP溶液，將稀釋的H2O2溶液逐滴加入(控制滴加時間為1 h)到反應體系中。滴加完畢，再繼續(xù)反應16 h。用50%的丙酮-水溶液破乳，沉淀濾除后再用水洗，放入真空干燥箱，50℃干燥48 h得聚苯胺粉末。

1.3 HRP活性測定

反應在含有(或不含)10 mmol·L-1SDS的不同pH值的0.2 mmol·L-1Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中進行，以10 mmol·L-1鄰甲氧基苯酚為底物、HRP為催化劑，用H2O2引發(fā)反應后立即放置分光光度計監(jiān)測470 nm處吸光度的變化。

以每分鐘OD470變化0.01為1個酶活力單位(U)。

1.4 產(chǎn)物表征

用UV-雙光束紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責任公司)測聚合物的紫外可見光譜；用Nicolet 170SX型FTIR光譜儀(美國Nicolet)測聚合物的紅外光譜，KBr壓片法制樣；用HMS-775型電導率儀(Lakeshore公司)測聚合物的電導率；用DTG-60H型熱解重量分析儀(日本島津公司)測聚合物的熱穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 pH值對聚合反應的影響

pH值是合成導電聚苯胺過程中最重要的影響因素之一，苯胺只有在pH值低于4.6的條件下才能形成導電聚合物(苯胺的pKa為4.6)[9]。但酶活性在較低的pH值條件下會受到較大影響。研究了pH值在1.0～4.0范圍內(nèi)HRP催化苯胺聚合的反應，結果見圖1。

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmmol·L-1；[H2O2]=20 mmmol·L-1

實驗中發(fā)現(xiàn)，將H2O2滴加到反應體系中后，pH值為1.0～3.0的反應體系均為翠綠色透明溶液，而pH值為4.0的反應體系則立即出現(xiàn)黑色沉淀。由圖1可知，pH值為4.0的反應體系在700～900 nm范圍內(nèi)無吸收峰出現(xiàn)，而其在570 nm出現(xiàn)的吸收峰說明有非導電性的支鏈聚合物產(chǎn)生；當pH值降至3.0時，在700～900 nm范圍內(nèi)基本無吸收峰出現(xiàn)；當pH值為2.0時，在750 nm有很強的吸收峰，說明產(chǎn)生了導電聚苯胺；當pH值進一步降至1.0時，吸收峰減小且吸收峰的位置紅移至715 nm左右[9，10]。

對聚合產(chǎn)物干燥處理后所得粉末進行電導率檢測，結果表明pH值為1.0～2.0的反應體系得到了具有較高導電性的聚苯胺(表1)，且pH值為2.0的體系得到的聚合物電導率最高。表明HRP催化導電聚合物的最適pH值為2.0，因此后續(xù)反應中選擇體系的pH值為2.0。

表1 不同pH值條件下得到的PANI的電導率

2.2 HRP催化苯胺聚合作用的探討

據(jù)文獻報道，HRP在pH值低于4.3時會很快失去活力[11]，而SDS是一種陰離子表面活性劑，常作為蛋白變性劑應用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，因此SDS的存在將降低酶的活性。測定含有SDS或不含SDS的體系中HRP的活力，結果見圖2。

注：[HRP]=2.75×10-3 mmol·L-1；[Guaiacol]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=100 mmol·L-1

由圖2可知，含有SDS的體系在pH值1.6～3.0范圍內(nèi)幾乎不表現(xiàn)HRP活力；在不含SDS的體系中，pH值低于2.0時也幾乎沒有HRP活力；而pH值大于2.0時，HRP的活力隨著pH值的增大顯著增強。這說明低pH值和SDS的存在都是造成HRP失活的原因。

為進一步探討HRP在導電聚苯胺聚合反應(以苯胺聚合體系在750 nm的吸光度表示，下同)中的作用，將HRP預先在沸水中處理15～30 min，使HRP在加入到聚合反應體系之前就已經(jīng)失活，然后與未失活的HRP用于苯胺聚合反應進行比較，結果見圖3。

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

由圖3可知，至少在8 h內(nèi)，不論是否經(jīng)過失活處理，HRP均能催化導電聚苯胺的合成。Nabid等曾運用鐵卟啉和水溶性四磺酸化酞菁金屬為催化劑催化苯胺聚合，得到了導電聚苯胺[12，13]。因此，推測雖然HRP分子中的蛋白部分因嚴苛的反應條件(低pH值和變性劑SDS的存在)而變性失活，但其活性中心的鐵卟啉仍然能夠不受環(huán)境條件的影響而發(fā)揮其催化苯胺聚合的作用。

2.3 H2O2濃度對聚合反應的影響

選擇pH值為2.0的條件下考察H2O2濃度對苯胺聚合反應的影響，結果見圖4。

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1

由圖4可知，隨著H2O2濃度的增大，導電聚苯胺的吸收峰值也逐漸增強；當H2O2濃度達到60 mmol·L-1時，產(chǎn)物的吸收峰趨于平穩(wěn)。但實驗中觀察到，H2O2濃度過高時(>20 mmol·L-1)會導致反應副產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時考慮到較高濃度的H2O2會抑制HRP的活性，因此，選擇H2O2濃度保持在20 mmol·L-1左右為宜。

2.4 SDS濃度對聚合反應的影響(圖5)

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

由圖5可知，SDS濃度為20 mmol·L-1時產(chǎn)物吸收峰很強，SDS濃度為40 mmol·L-1或小于10 mmol·L-1都會影響導電聚苯胺的生成。這是因為，SDS在水中可以形成膠束，這種膠束能夠為苯胺單體的聚合提供適合的環(huán)境，在pH值為2.0的條件下，SDS帶負電荷、苯胺單體帶正電荷，因而SDS自組裝形成的膠束將吸引苯胺單體在其周圍聚集，進而促進水溶性導電聚合物的產(chǎn)生。SDS的濃度過低(<8.6 mmol·L-1)時在水溶液中就無法形成膠束，從而失去模板導向作用，使得聚合反應變慢，相同反應時間內(nèi)導電聚合物的生成量較少。而SDS濃度太高又會顯著降低HRP的活性，也不利于導電聚合物的生成。因此，選擇SDS濃度在20 mmol·L-1為宜。

2.5 聚苯胺復合物的表征

2.5.1 FTIR(圖6)

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

2.5.2 TGA(圖7)

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

由圖7可知，3種不同pH值下得到的PANI/SDS復合物在150℃以下都出現(xiàn)失重，在此溫度范圍內(nèi)失重的應是水分。主要的失重出現(xiàn)在300℃以上，當溫度升高到600℃時，3種PANI/SDS復合物保留率約30%，表明復合物具有較好的熱穩(wěn)定性。當溫度升高到800℃時，pH值為3.0的條件下得到的PANI/SDS復合物保留率較其余兩種稍高，因此其熱穩(wěn)定性相對較好。

3 結論

以HRP為催化劑，在SDS膠束水溶液中進行了水溶性導電聚苯胺的合成，對HRP在pH值1.0～4.0反應體系中催化導電聚苯胺合成的反應進行了研究。紫外可見掃描光譜分析和電導率測定的結果表明，在以SDS為模板的條件下，HRP催化水溶性導電聚苯胺合成的最適pH值為2.0、最適的SDS和H2O2濃度都在20 mmol·L-1左右。進一步測定HRP的活性發(fā)現(xiàn)，HRP pH值低于2.0時蛋白部分變性失活，但仍可催化導電聚苯胺的合成，推測HRP在催化導電聚苯胺的合成過程中主要依靠其活性中心的鐵卟啉發(fā)揮其催化作用。運用FTIR和TGA等方法對合成的PANI/SDS復合物進行了表征，該復合物具有典型的導電聚苯胺復合物特征以及較好的熱穩(wěn)定性。

[1] Bhadra S，Khastgira D，Singha N K.Progress in preparation，processing and applications of polyaniline[J].Progress in Polymer Science，2009，34(8)：783-810.

[2] Liu W，Kumar J，Tripat hy S，et al.Enzymatically synthesized conducting polyaniline[J].J Am Chem Soc，1999，121(1)：71-78.

[3] Samuelson L A，Anagnostopoulos A，Shridahra Alva，et al.Biologically derived conducting and water soluble polyaniline[J].Macromolecules，1998，31(13)：4376-4378.

[4] Karamyshev A V，Shleev S V，Koroleva O V，et al.Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，33(5)：556-564.

[5] Sakharov I Y，Vorobiev A C，Castillo J J.Synthesis of polyelectrolyte complexes of polyaniline and sulfonated polystyrene by palm tree peroxidase[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，33(1)：661-667.

[6] Sangrama K S，Ramaswamy N，Sucharita R，et al.An enzymatically synthesized polyaniline：A solid state NMR study[J].Macromolecules，2004，37(11)：4130-4138.

[7] Nagarajan R，Trypathy S K，Kumar J，et al.An enzymatically synthesized conducting molecular complex of polyaniline and poly(vinylphosphonic acid)[J].Macromolecules，2000，33(26)：9542-9547.

[8] Nagarajan R，Liu W，Kumar J，et al.Manipulating DNA conformation using intertwined conducting polymer chains[J].Macromolecules，2001，34(1)：3921-3927.

[9] Hu X，Zhang Y Y，Tang K，et al.Hemoglobin-biocatalysts synthesis of a conducting molecular complex of polyaniline and sulfonated polystyrene[J].Synthetic Metals，2005，150(1)：1-7.

[10] Rodolfo C S，Jorge R G，Jose L A，et al.Template-free enzymatic synthesis of electrically conducting polyaniline using soybean peroxidase[J].European Polymer Journal，2005，41(5)：1129-1135.

[11] Chattopadhyay K，Mazumdar S.Structural and conformational stability of horseradish peroxidase：Effect of temperature and pH[J].Biochemstry，2000，39(11)：263-270.

[12] Nabid M R，Sedghi R，Jammat P R，et al.Synthesis of conducting water-soluble polyaniline with iron (Ⅲ) porphyrin[J].Applied Polymer Science，2006，102(3)：2929-2934.

[13] Nabid M R，Sedghi R，Jammat P R，et al.Catalytic oxidative polymerization of aniline by using transition-metal tetrasulfonated phthalocyanine[J].Applied Catalysis A：Genaral，2007，328(1)：52-57.

[14] Gu Y S，Chen C C，Ruan Z W.Enzymatic synthesis of conductive polyaniline using linear BSA as the template in the presence of sodium dodecyl sulfate[J].Synthetic Metals，2009，159(19-20)：2091-2096.